THC-COOH – 20 ng L-1

Analýza návykových látek a jejich
metabolitů v životním prostředí.
Roman Grabic, Tomáš Randák, Ganna Fedorova
www.frov.jcu.cz
Laboratoř environmentální chemie a biochemie
 Studium vlivu cizorodých látek na exponované organismy (terénní i laboratorní studie)
 Detekce širokého spektra cizorodých látek (voda, rybí tkáně, sedimenty, pasivní
vzorkovače, atd.)
 Vývoj nových efektivních analytických metod pro stanovení stopových koncentrací
cizorodých látek (farmak, drog, pesticidů, atp.) ve vzorcích složek životního prostředí
 Odpovídající vybavení LC/LC-MS/MS, LC/LC-MS/HRMS, GC-MS/MS
Přeměna drog v organismu člověka
Dávka 20 mg MDMA
Částečná
metabolická přeměna
Z těla je vyloučeno
cca 13 mg MDMA
Pro detekci konzumace drog (nebo i jiných látek jako jsou léčiva) je
nutné vybrat
• Přímo danou látku – metamfetamin, MDMA
• Vhodný (selektivní) metabolit – benzoylecgonin, 6-acetylmorfin
• Cokoliv co lze nalézt – THC-COOH (pouze 0,6% zkonzumované
drogy)
Rozsah analytů
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Zakázané a návykové látky
Jejich metabolity
Psychoaktivní léčiva s potenciálním dopadem na životní prostředí
2-Oxy-3-hydroxy-LSD
Amphetamine
Benzoyecgonine
Cathinone
Citalopram
Cocaine
Codeine
EDDP
Ketamine
LSD
MBDB
MDA
MDEA
MDMA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mephedrone
Metamphetamine
Methadone
Methylphenidate
Midazolam
Norbuprenorphine glucoronide
Norketamine
Oxazepam
Oxycodone
Risperidone
THC-COOH
Tramadol
Venlafaxine
Drogy v životním prostředí
• Vstupují do životního prostředí přes ČOV po
exkreci a částečné metabolické přeměně
• Z koncentrací drog a jejich metabolitů lze
odhadnout konzumaci drog v dané lokalitě
• Nároky na analýzu
• Těžká matrice – odpadní voda před očištěním
• Nepříliš stabilní sloučeniny – rychlost přípravy a
extrakce – LC/LC-MS/MS
• Vysoké počty vzorků
• Relativně obtížná chromatografie
• Správnost – eliminace matricových efektů
• Selektivita
Příprava vzorků a jejich analýza
 Konvenční postup analýzy
vody
 Filtrace 100 ml vody
 SPE extrakce
 Časově a manuálně velmi pracná
metoda
 High throughput methods
 Minimalizování objemu vzorku
 5-10 ml
 Jednoduchá a rychlá filtrace
 Přidání vnitřního standardu
 Automatizovaná extrakce a
analýza v jednom kroku
Příprava vzorků a jejich analýza
Nástřik vzorku
Extrakce vzorku
Šesticestný nástřikový
ventil
Loading
pump
Loading
pump
Analytical
pump
Analytical
pump
SPE
C18
Bidentate
SPE
Deseticestný přepínací
ventil
C18
Bidentate
Příprava vzorků a jejich analýza
Analýza vzorku
Extrakční kolona
C18 Hypersil Gold (ThermoScientific)
20mm x 2.1mm, 12µm particles
Šesticestný nástřikový
ventil
Loading
pump
Analytical
pump
Analytická kolona
C18 Cogent Bidentate (MicroSolv
Technologies Corp.)
50mm x 2.1mm, 4µm particles
SPE
Deseticestný přepínací
ventil
C18
Bidentate
QqQ MS/MS metoda detekce
State of art
vysoce citlivá a selektivní
metoda detekce je MS/MS
na trojitém kvadupólu
70
0,200
0,180
60
0,160
 Pro nastavení metody jsou
potřebné standardy
 Běžně se dá analyzovat >120
sloučenin najednou
 Je jednoduché přidat nebo
odebrat analyt z metody
 Metoda pro drogy a farmaka v
jedné analýze
 15 min. extrakce + analýza
0,140
0,120
40
0,100
30
0,080
0,060
20
0,040
10
0,020
0
0,00
2,00
4,00
8,00
Retention6,00
time (min)
10,00
0,000
12,00
Scan Time (s)
Vždy jde o cílenou
analýzu:
Order of analyte
50
QqQ MS/MS detekce
QqQ MS/MS
10 ng nativního analytu /100 ng IS na L
Q1 0.7 FWHM Q3 0.7 FWHM
QqQ MS/MS
10 ng nativní sloučeniny/100 ng IS na L
Q1 0.7 FWHM Q3 0.7 FWHM
RT: 9.01 - 11.02 SM: 5G
RT: 3.92 - 7.29 SM: 5G
5.58
100
Metamfetamin
quan
80
60
10.49
NL: 2.08E5
100
m/z= 90.50-91.50 F: + c
ESI SRM ms2 150.100
80
[65.239-65.241;
90.929-90.931] MS
Drug_WW_LC_LC_137
60
THC-COOH
quan
5.65
NL: 1.82E4
m/z= 298.5000-299.5000
11.01 F: + c ESI SRM ms2
345.200 [192.669-192.671;
10.73 10.89 10.93 298.779-298.781] MS
Drug_WW_LC_LC_154
10.53
10.66
10.08
10.26 10.34
10.15
10.56
40
40
5.69
20
5.30
5.81 6.02 6.09
0
100
5.56
Metamfetamin
qual
80
60
5.53
5.65
5.43
40
5.72
5.81
5.98
5.35
20
0
NL: 5.46E4
100
m/z= 64.50-65.50 F: + c
ESI SRM ms2 150.100
80
[65.239-65.241;
90.929-90.931] MS
Drug_WW_LC_LC_137
60
5.60
10.12
10.35
10.68
10.75
10.24
20
0
NL: 1.15E6
100
TIC F: + c ESI SRM ms2
155.100 [91.569-91.571]
MS
80
Drug_WW_LC_LC_137
Metamfetamin
IS
60
10.54
10.60
40
5.55 5.58
80
10.49
10.21
6.04 6.15
0
100
NL: 3.61E3
m/z= 192.5000-193.5000
F: + c ESI SRM ms2
345.200 [192.669-192.671;
298.779-298.781] MS
Drug_WW_LC_LC_154
10.52
THC-COOH
qual
Relative Abundance
20
60
10.77
10.98
10.46
NL: 6.00E4
m/z= 307.5000-308.5000
F: + c ESI SRM ms2
354.200 [307.529-307.531]
MS
Drug_WW_LC_LC_154
THC-COOH
IS
40
40
20
20
5.33
5.84 5.88
10.07 10.20
6.13
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
10.40
10.58
10.72
10.85
11.01
0
0
5.6
5.8
Time (min)
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
9.2
9.4
9.6
9.8
10.0
Time (min)
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0
HRMS detekce v analýze
Konvenční QqQ MS/MS
• Stanovení koncentrací
• Není použitelná pro screening
• Selektivita pro drogy není
optimální
•
•
•
•
Hybridní kvadrupól/Orbitrap
MS/MS
Vysoké rozlišení (až 140000
FWHM) v plném skenu HRFS
MS/HRMS 0,7/17500 HRPS
vysoké rozlišení v produktovém
skenu
Identifikace neznámých látek v
HRFS
Potvrzení v HRPS
HRMS detekce v analýze
Jaký je rozdíl mezi vysokým a nízkým rozlišením?
Nízkorozlišující MS může být
jednoduše přirovnána k fotografii se
starými digitálními fotoaparáty.
Vysokorozlišující MS pak může být
porovnány s nejlepšími fotoaparáty.
http://ccideas.com/chatter/high-resolution-images-vs-low-resolution-images-a-short-primer-for-beginners/
HRMS detekce v analýze
Příklad : desacetyl,desmethyl Diltiazem v rybí plazmě
Screen_19 #562-910 RT: 6.83-10.20 AV: 175 NL: 8.11E6
T: FTMS + p ESI Full ms [100.00-600.00]
RT: 0.00 - 12.01
359.2209
100
95
Chromatogram v
nízkém rozlišení
90
95
85
80
75
90
70
65
60
Relative Abundance
85
80
NL: 8.26E7
m/z=
358.6418-359.6418
F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-600.00]
MS ICIS Screen_19
RT: 9.14
AA: 945859349
SN: 81042
100
RT: 9.72
AA: 998623068
SN: 39045
55
R = 1000 FWHM
50
45
40
35
RT: 8.50
AA: 22232356
SN: 2622
30
75
RT: 10.47
AA: 4858180
SN: 1320
25
20
RT: 1.43
AA: 8931236
SN: 2307
RT: 2.64
AA: 97529979
SN: 4102
15
70
10
5
RT: 6.62
AA: 99551113
SN: 4958
RT: 4.65
AA: 50634257
SN: 2318
RT: 7.80
AA: 121231844
SN: 6726
RT: 11.33
AA: 27605402
SN: 4532
0
65
0
1
2
3
4
5
6
Time (min)
7
8
9
10
11
12
Rozdíl mezi vysokým a nízkým
rozlišením v plném skenu
60
55
50
RT: 0.00 - 12.01
45
RT: 9.14
AA: 454730267
SN: INF
100
Chromatogram ve
vysokém rozlišení
95
40
90
85
80
35
75
70
65
359.1418
25
60
Relative Abundance
30
NL: 6.50E7
m/z=
359.1382-35
F: FTMS + p
ms [100.00MS ICIS Sc
55
R = 70 000 FWHM
50
45
40
35
20
30
25
20
15
15
10
RT: 8.46
AA: 580858
SN: INF
5
10
359.2572
0
0
1
2
3
4
5
6
Time (min)
360.1453
5
358.4862 358.6265 358.7121
0
358.4
358.6
358.8722 358.9616
358.8
359.1031
359.0
359.2976
359.2
359.4
m/z
359.4966 359.6169 359.7086 359.8286
359.6
359.8
360.0
7
8
9
10
11
12
Zlepšení detekce – HRMS
Q-Exactive
vs
•
•
•
•
•
•
QqQ
Linearita
LOQ
Správnost
Matricový efekt
Přesnost
Selektivita
Linearita
10 – 2000 ng L-1
Správnost
20, 200 a 1000 ng L-1
Matricový efekt
Rozdíl v odezvových faktorech v pitné a odpadní vodě
Přesnost
10 opakování pro každou koncentrační hladinu
Selektivita
Přítomnost/absence interferencí
Parametry metody
Linearita
Hodnoty R2 v rozsahu 0.996 – 1 pro všechny sloučeniny a metody v
rozsahu od 10 do 2000 ng/L
Přesnost/Opakovatelnost
< 20% RSD pro většinu sloučenin
Vyšší hodnoty RSD pro koncentraci 20ng/L
•
•
•
•
•
QqQ MS/MS
Amfetamin – 22%
Cathinone– 29%
MDEA – 24%
Methylphenidate – 29%
Oxycodone – 36%
•
•
HRFS Full scan
2-oxy-3-hydroxy-LSD – 31%
Cathinone – 30%
Matricový efekt
Více než 20% pro většinu cílových sloučenin
Zvýšení ionizace: převládají efekt a efekt s vyšším účinkem
Parametry metody
Výtěžnost – parametr správnosti metody
Dobré výtěžnosti v MS/MS a HRPS pro všechny úrovně obohacení vzorku
Vyjímka pro MS/MS (20 ng L-1)
• Cathinone
• MDA
• Norbuprenorphine glucoronid
•
Vyjímka pro HRPS (20 ng L-1)
Norbuprenorphine glucoronid
HRFS většina analytů měla neakceptovatelné výtěžnosti na 20 a 200 ng L-1
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
2-oxy-3-hydroxy-LSD
Amphetamine
Cathinone
EDDP
Ketamine
LSD
MDMA
Mephedrone
Methadone
Methylphenidate
Norbuprenorphine glucoronid
•
•
•
Norketamine
Oxycodone
Risperidone
Parametry metody
Meze stanovitelnosti LOQ
1 – 13 ng L-1 pro většinu sloučenin a všechny metody
HRFS
0.46 – 13 ng L-1
MS/MS
1.3 – 15 ng L-1
•
•
•
Vyjímka
THC-COOH – 20 ng L-1
Amphetamine – 24 ng L-1
MDA – 181 ng L-1
•
HRPS
1.7 – 11 ng L-1
Vyjímka
Amphetamine – 54 ng L-1
Selektivita
MS/MS
25 z 27
analytů
HRFS
20 z 27
analytů
HRPS
27 z 27
analytů
HRPS nedává falešně pozitivní výsledky tak jako MS/MS (cathinone)
Porovnání metod
85
80
75
70
65
60
MS/MS
HRFS
HRPS
Porovnání metod
THC-COOH 10/100 (native/labeled) ng L-1
quan
qual
IS
quan
qual
IS
quan
qual
IS
Fedorova, G., Randak, T., Lindberg, R.H., Grabic, R., 2013. Comparison of the quantitative performance of a QExactive high-resolution mass spectrometer with that of a triple quadrupole tandem mass spectrometer for the analysis
of illicit drugs in wastewater. Rapid Communications in Mass Spectrometry 27: 1751-1762. .
Porovnání metod
Cílený screening
Shrnutí
• In-line SPE umožňuje výrazné zvýšení průchodnosti
laboratoře
• QqQ MS/MS je nejrychlejší metoda pro multiresiduální
analýzy >100 sloučenin v jednom nástřiku
• Q-Orbitrap MS/MS zásadně zvyšuje selektivitu
stanovení a v některých případech i citlivost detekce
• Není dostatečně rychlý pro skutečné multiresiduální
analýzy
• Použití HRMS v plném skenu pro screening je možné
• Vždy je nutné potvrzení identity pomocí MS/MS a
pokud možno i shodou RT