P3 -klonování

P3 -klonování
P1
5'
P3
P3
RNA +
5'
HC-Pro
Primer PVY5
5'
DNA +
3'
DNA -
5'
DNA +
3'
DNA -
CI
NIa
NIb
3'
CP
1.RT-PCR
Primer PVY3
P3+
P3-
5'
P3+
P3-
5'
2. Restrikce
P3 inzert
5'
T4 DNA ligáza + ATP
5'
3'
NcoI
Bgl II
3. Ligace
plazmid pMPM A4omega
5'
5'
3'
NcoI
araC
E. coli ori
amp R
f1 ori
5S
MCS
Legenda
araC - promotor indukovatelný arabinózou
MCS- multiple cloning site
E.coli ori, f1 ori - bakteriální poèátky replikace obsahuje: XhoI, SalI, ClaI, Hind III,
ampR - gen rezistence k ampicilinu
EcoRV, SphI, PstI, SmaI, BglII, SpeI
5S - ribozomální 5S RNA
ampR
pThioHis
ampR
lacZ
pMPM 4 Omega
P3
ara C
Nco I
MCS
Bgl II
5. pMPM
6xHis
P3
Nco I
MCS
Bgl II
4. pThioHis
6. Transformace
R
amp+
? inzert
selekèní médium
arabinóza
ampR +inzert
7. Indukce
IPTG
ampR +inzert
Potyviry
Virová èástice pøipomíná pružné vlákno
cca 760 nm dlouhé a 10 nm v prùmìru
(zobrazena je pouze èást)
CP-coat protein
virová èástice sestává
z 2000 kopií tohoto proteinu
VPg
protein kovaletnì vázaný
na virovou RNA
slouží místo èepièky pøi
translaci virových proteinù
ssRNA
genom potyvirù pøedstavuje
cca 9,6 kb dlouhá pozitivní
RNA, kódující jediný polyprotein
N- i C-terminální èásti
jsou orientovány do vnìjšího prostøedí
obì jsou pomìrnì variabilní
N-terminus nese motiv DAG
pro pøenos mšicemi
Potyviry
Potyviry tvoøí nejvìtší skupinu rostlinných virù
s pøibližnì 150 èleny
napadají snad všechny kulturní rostliny
pøenášeny jsou pøedevším hmyzem
jejich genom je pøekládán do jednoho polyproteinu,
který je autoprotelyticky štìpen na 7 až 10 proteinù
všechny proteiny se exprimují v ekvimolárním pomìru
Obalový protein má schopnost
samosestavení bez pøítomnosti RNA