Spektrofotometrické stanovení železa 1,10

SPEKTROFOTOMETRIE
VE VIDITELNÉ OBLASTI SPEKTRA
Alla Sinica
Obecné základy
Molekuly mají schopnost pohlcovat elektromagnetické záření pouze určitých vlnových
délek. Je to dáno tím, že mohou existovat v určitých kvantových stavech, které se liší
obsahem energie. Jestliže má molekula přejít ze stavu s nižší energií do stavu s energií vyšší,
musí absorbovat záření o frekvenci v, která právě odpovídá rozdílu energií mezi
energetickými hladinami Ep a Eq obou kvantových stavů podle Bohrovy frekvenční podmínky:
ΔE = Ep - Eq = h v = h c / λ
(1)
kde c je rychlost světla, λ vlnová délka a h je Planckova konstanta (6,626 ·10-34 J s); podle
konvence je excitovaná hladina označena indexem p, základní indexem q.
Energeticky nejnáročnější jsou přechody mezi elektronovými energetickými hladinami.
Běžně jsou způsobeny absorpcí ultrafialového (190 až 400 nm) a viditelného záření (400 až
800 nm). Absorpci záření lze měřit na přístrojích, které nazýváme absorpční spektrofotometry.
Při absorpčním měření je ze vstupujícího toku záření Φo část absorbována vzorkem
(absorbovaný zářivý tok ΦA) a v ideálním případě zbytek projde a je zaznamenán jako
vystupující zářivý tok Φ.
Φo
Φ
zářivý tok
vstupující
zářivý tok
vystupující
zářivý
tok
absorbovaný
ΦA
Podíl zářivých toků Φ a Φo se nazývá propustnost neboli transmitance:
τ = Φ / Φo
1
(2)
Na většině spektrofotometrů lze také odečíst hodnotu absorbance A, tj. záporně vzatý
logaritmus propustnosti:
A = - log τ = log (Φo /Φ)
(3)
Konstrukčně se spektrofotometry dělí na jednopaprskové a dvoupaprskové. V našich
laboratořích používáme jednopaprskový spektrofotometr, který měří pouze vystupující tok
záření. Proto je třeba provést dvě měření: vedle měření vzorku (Φ) ještě srovnávací pokus
(Φo), při kterém se měří slepý vzorek, kde nedochází k absorpci.
Závislost propustnosti či absorbance na vlnové délce (frekvenci) nazýváme absorpční
spektrum. Absorpční spektrum je tvořeno absorpčními pásy. Absorpční pás charakterizujeme
polohou jeho maxima, propustností (nebo absorbancí) v maximu a tvarem. Absorpční
spektrum slouží k identifikaci sloučenin, zejména organických, s chromoforními skupinami,
jako např. C=O, N=N, N=O, konjugovanými dvojnými vazbami apod.
Velká většina kationtů ve zředěných vodných roztocích vykazuje jen nepatrnou vlastní
absorpci. Kationty se proto převádějí do barevných stabilních komplexů reakcí s
komplexotvornými činidly obsahujícími chromoforní skupiny. Vznik komplexu obvykle
vyžaduje prostředí o vhodné hodnotě pH apod.
Těžiště aplikací absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti spektra je v
kvantitativní analýze. Kvantitativní analýza je založena na Lambertově-Beerově zákoně,
podle kterého je hodnota absorbance A při vlnové délce λ přímo úměrná látkové koncentraci c
(mol l-1). V případě jediné absorbující látky platí:
Aλ = ελ b c = k·c
(4)
Konstantou úměrnosti je součin tloušťky vrstvy b (cm) a molárního absorpčního
koeficientu při dané vlnové délce ελ, který má rozměr l mol-1 cm-1. Z uvedeného vztahu dále
vyplývá, že součin ελ.b je pro měření stejného analytu při stejné vlnové délce a ve stejné
kyvetě konstantní a může být nahrazen konstantou k.
Lambertův-Beerův zákon platí pro monochromatické elektromagnetické záření a obor
nízkých koncentrací, řádově menších než 10-2 mol l-1. Pro kvantitativní analýzu je nutné
vybrat takovou vlnovou délku, při níž stanovovaná látka silně absorbuje (nejlépe maximum
absorpčního spektra) a případné interferující látky mají absorpci minimální.
Při spektrofotometrickém stanovení se obvykle pracuje srovnávacím způsobem, protože
hodnota molárního absorpčního koeficientu stanovované látky při zvolené vlnové délce
nebývá známá. Proto se měří vedle vzorku i standardní roztok. Konstantu úměrnosti k ze
vztahu (4) pak zjistíme z absorbance Ast a koncentrace cst standardního roztoku podle vztahu:
k=Ast/cst=Avz/cvz
(5)
Z naměřené absorbance Avz a vypočtené konstanty k pak lze vypočítat neznámou látkovou
koncentraci vzorku cvz. V praxi se však většinou nespokojíme se standardním roztokem o
jediné koncentraci, ale použijeme tzv. metodu kalibrační křivky.
Při tomto postupu se změří absorbance několika kalibračních roztoků o různých
koncentracích, samozřejmě v téže kyvetě a při stejné vhodně zvolené vlnové délce. Z průběhu
získané závislosti absorbance na koncentraci, tj. z kalibrační křivky lze ověřit platnost
Lambertova-Beerova zákona. Výsledná závislost by měla být přímka procházející počátkem a
nazýváme ji kalibrační přímkou. Tato metoda je použitelná, pokud stanovujeme danou látku
2
v jednoduché, snadno napodobitelné matrici (např. v pitné vodě, kterou lze pro některá
stanovení dobře modelovat destilovanou vodou).
Často je ovšem třeba danou látku stanovit ve složité matrici, např. v odpadní vodě nebo
v složité biologické matrici. Modelovou matricí pro přípravu kalibračních roztoků by v tomto
případě musela být totožná odpadní voda nebo biologický materiál ovšem neobsahující
stanovovanou látku, což je těžce proveditelné. Pak je výhodné použít metodu standardního
přídavku.
Při stanovení neznámé koncentrace vzorku cvz metodou standardního přídavku se změří
absorbance neznámého vzorku Avz a pak se koncentrace stanovované látky ve vzorku zvýší
definovaným přídavkem standardu a změří se odpovídající absorbance roztoku. Opět platí
vztah (5). Stejně jako u metody kalibrační přímky se provádí často více přídavků a
koncentrace vzorku se vyhodnocuje pomocí statistických metod (lineární regrese). Postup je
podobný jako u předchozí metody.
Připraví se sada roztoků obsahující vedle stále stejného množství měřeného vzorku i
různé známé přídavky standardního roztoku stanovované látky. Výchozím měřením je roztok
vzorku bez přídavku standardního roztoku – odpovídá absorbanci Avz. Do grafu se pak vynáší
naměřené absorbance proti změnám koncentrace (rozdílům oproti koncentraci vzorku). Ze
směrnice k získané závislosti a výchozí hodnoty absorbance Avz se vypočítá koncentrace
vzorku cvz.
Absorpční spektrofotometr
Základními části absorpčního spektrofotometru
Absorpční spektrofotometr je tvořen čtyřmi základními částmi: 1. zdrojem záření, 2.
monochromátorem, 3. absorpčním prostředím a 4. detekčním systémem.
1.
Zdrojem spojitého elektromagnetického záření pro viditelnou oblast je běžně
wolframová nebo halogenová žárovka.
2.
Monochromátor je tvořen vstupní a výstupní štěrbinou, rozkladným prvkem a
zrcadlovou nebo čočkovou soustavou. Rozkladným prvkem může být hranol nebo
reflexní mřížka. Pro viditelnou oblast spektra, tj. 400 - 800 nm, je hranol ze skla.
Natáčením rozkladného prvku se postupně zobrazují jednotlivé monochromatické
obrazy vstupní štěrbiny na štěrbinu výstupní.
3.
Absorpční prostředí tvoří kyveta s měrným, příp. srovnávacím roztokem. Materiál
kyvet se řídí měřenou oblastí spektra. Pro viditelnou oblast jsou okénka kyvety ze skla.
Absorpční prostředí tvoří většinou roztok látky ve vhodném rozpouštědle. Nejběžnějším
rozpouštědlem pro viditelnou oblast spektra je destilovaná voda.
4.
Detekční systém je složen z detektoru záření a elektronického zařízení na zpracování
jeho odezvy. Detektor převádí zářivý tok na elektrický signál. Pro detekci záření ve
viditelné oblasti se používají fotonky nebo fotonásobiče, selénové hradlové fotočlánky,
fotoodpory apod. Signál z detektoru se zpracovává v zesilovači a jeho výstup se zobrazí
na číslicovém displeji.
Svazek polychromatického záření vycházející ze zdroje dopadá na vstupní štěrbinu
monochromátoru. Po rozkladu na reflexní mřížce nebo hranolu vychází z výstupní štěrbiny
svazek přibližně monochromatického záření, které je charakterizováno intervalem vlnových
3
délek, které projdou výstupní štěrbinou. Střední hodnotou tohoto intervalu je nastavená vlnová
délka. Velikost intervalu je závislá na konstrukci přístroje (pro Marcel MINI (Obr. 1.) je asi
10 nm). Po průchodu absorpčním prostředím dopadá monochromatické záření na
fotoelektrický detektor a vzniklý fotoproud se převádí na digitální výstup.
absorpční prostředí
(kyvetový prostor)
tiskárna
ovládací panel
Obr. 1. Absorpční spektrofotometr MARCEL MINI
STANOVENÍ ŽELEZA 1,10-FENANTHROLINEM
Úkoly:
1. Proměřte elektronové absorpční spektrum komplexu a nalezněte vlnovou délku
maxima absorpčního spektra.
2. Zjistěte časovou stálost komplexu.
3. Proměřte závislost absorbance na koncentraci komplexu a sestrojte kalibrační graf.
Stanovte obsah železa ve vzorcích pitné vody metodami kalibrační přímky a
standardního přídavku.
4. Zjistěte stechiometrii a vypočítejte konstantu stability vzniklého komplexu metodou
kontinuálních variací (Jobova metoda).
5. Zpracujte a vyhodnoťte výsledky.
Princip
Ke stanovení železa ve vodných roztocích se používá velmi stabilní, komplex
dvojmocného železa (Fe2+) s třemi molekulami 1,10-fenanthrolinu, vznikající při pH = 2 až 9.
4
Předpokladem kvantitativního stanovení je kvantitativní vznik komplexu (tzn. alespoň
99,99% Fe2+ je ve formě komplexu), chemická stálost komplexu v daném prostředí a rychlost
vzniku komplexu. Ta musí být dostatečně vysoká, abychom mohli předpokládat, že komplex
vzniká v době, která uplyne od namíchání roztoku do změření absorbance.
Aby přítomné železo bylo ve formě Fe2+ (s trojmocným železem komplex nevzniká),
přidává se redukční činidlo, jako např. hydroxylamin. Reakce je velmi citlivá a dovoluje
stanovit i velmi nízké koncentrace železa, řádově mg l-1. Lambetův-Beerův zákon platí do
koncentrací železa cca 60 mg l-1.
Návod k měření absorbance na spektrofotometru Marcelu MINI
Pro stanovení železa 1,10-fenanthrolinem se používá poloautomatický jednoduchý
absorpční spektrofotometr Marcel Mini (Obr. 1.). Jedná se o jednopaprskový absorpční
spektrofotometr s mřížkovým monochromátorem, měřící ve spektrálním rozmezí 330 - 850
nm.
Přístroj zapojíme síťovou šňůrou na 220 V a na Marcelu MINI zapneme síťový
vypínač na pravé boční stěně. Po jeho stisknutí vypínač se rozsvítí zelenym světlem. Necháme
přistroj krátkou dobu temperovat (asi 5 –10 min).
1.
Absorpční spektrum komplexu
Po stisknutí tlačítka PROGRAM se objeví nabídka programu. Pomocí šipek se zvolí
program Abs. spektrum (číslo 1), který umožňuje změřit spektrum vzorku v rozmezí
vlnových délek 400-800 nm s krokem 3 nm. Tlačítkem ENTER startujeme zvoleny
program.
2.
Vynulování (zeroing) přístroje provádíme po vložení kyvety s rozpouštědlem
(destilovanou vodou) tlačítkem ZERO A. Vynulovat přístroj stačí jednou na začátku
práce. Kyvetu, zvolenou pro referenční měření (zeroing) budeme používat i v dalších
postupech.
3.
Měření vlastního vzorku je možné spustit tlačítkem ENTER (Start of measure). Na
obrazovce monitoru se za několik vteřin objeví změřené absorpční spektrum vzorku.
Hodnoty vlnových délek a příslušných absorbancí je možno prohlížet pomocí šipek.
Vodorovnými šipkami doprava, doleva kurzorem se posunujeme mezi body naměřené
křivky. Na displeji se objevují hodnoty absorbance odpovídající poloze kurzoru. Takto
lze najít absorpční maximum a jemu odpovídající vlnovou délku, kterou pak použijeme
při dalších měřeních.
4.
Vrátíme se k základní stránce menu tlačítkem PROGRAM
5
Kinetika tvorby a časová stálost komplexu
1.
Pro zjištění časové stálosti komplexu zvolíme program č 2 (kinetická měření).
2.
Zkontrolujeme nastavenou hodnotu vlnové délky. Jestli hodnota uváděné vlnové délky
odpovídá hodnotě vlnové délky vašeho absorpčního maxima, pokračujete tlačítkem
ENTER (Start program). Jestli hodnota uváděné vlnové délky neodpovídá hodnotě
vlnové délky vašeho absorpčního maxima, je zapotřebí ji opravit na vaši vlnovou
délku.1 (Poznámka pod čarou 1). Měření spustíte tlačítkem START a pak potvrzením
ENTER vašeho prvního pokusu (Number of cells).
3.
Spuštěný program kinetické měření dovoluje sledovat časovou stálost komplexu po
dobu 5 minut. Každých 30 sekund se hodnota absorbance zobrazuje na grafu
odrážejícím průběh závislosti absorbance na čase u čerstvě připraveného roztoku.
4.
Vrátíme se k základní stránce menu tlačítkem PROGRAM
Sestrojení kalibračního grafu a stanovení obsahu železa ve vzorcích pitné vody
metodou kalibrační přímky
1.
Pro sestrojení kalibrační přímky a stanovení obsahu železa v neznámých vzorcích
zvolíme program č 4. (kalibr. přímka).
2.
Zkontrolujeme nastavenou hodnotu vlnové délky. Jestli hodnota uváděné vlnové délky
odpovídá hodnotě vlnové délky vašeho absorpčního maxima, pokračujete tlačítkem
ENTER. Jestli hodnota uváděné vlnové délky neodpovídá hodnotě vlnové délky vašeho
absorpčního maxima, je zapotřebí ji opravit na vaši vlnovou délku.1
3.
Pro sestrojení kalibrační přímky stiskněte dvakrát za sebou tlačítko CALIBR. Dostanete
se do tabulky, kde se v prvním sloupci uvádějí hodnoty koncentrace standardních
roztoků a v druhem sloupci se ukládají naměřené hodnoty absorbance.
4.
Vypočítejte koncentraci vámi připravených standardních roztoků a uveďte hodnoty do
tabulky. Pro to použijte tlačítko PROGRAM a zadejte hodnoty x10-5 mol l-l
koncentrace. Po zapsání hodnot koncentrace ENTERem potvrďte její akceptovatelnost.
5.
Měření se aktivují vložením do kyvetového prostoru vzorku a změřené hodnoty se
ukládají tlačítkem START (Insert measurement).
6.
Po změření všech standardů se kalibrace uloží tlačítkem ENTER (Save calibration).
Poté se na obrazovce ukáže kalibrační přímka.
7.
Po uložení kalibrační přímky tlačítkem ENTER (End of calibration) se průběžně do
kyvetového prostoru vkládají neznámé vzorky a na obrazovce se ukazuje vedle hodnoty
absorbance i odpovídající hodnota měřené koncentrace vypočtená z kalibrační přímky.
Obě hodnoty opište do sešitu. Průměrnou hodnotu koncentrace ze třech samostatných
opakování použijte pro vypočet hmotnostního obsahu železa ve vzorcích pitné vody.
Vlnovou délku v programu lze změnit pomoci tlačítek PROGRAM, pak z nabídky zvolit tlačítko 2 ( Modify
selected program), na stránce „Programing – stage II“ přepsat jenom hodnotu vlnové délky (wavelength) a
potvrdit tlačítkem ENTER. Všechny další parametry zůstávají nezměněny. Použitím tlačítka ENTER se vrátíte
k stránce zvoleného programu. Zkontrolujme uvedenou vlnovou délku a tlačítkem ENTER spustíme zvolený
program. K tomuto kroku je zapotřebí přistoupit po každé pro zvolení nového úkolu a nastavení vhodné vlnové
délky.
1
6
Stanovení obsahu železa ve vzorcích pitné vody metodou standardního přídavku
1.
Pro stanovení obsahu železa v neznámých vzorcích pitné vody metodou standardního
přídavku zvolíme program č 5. (stand. přídavek).
2.
Zkontrolujeme nastavenou hodnotu vlnové délky. Jestli hodnota uváděné vlnové délky
odpovídá hodnotě vlnové délky vašeho absorpčního maxima, pokračujete tlačítkem
ENTER. Jestli hodnota uváděné vlnové délky neodpovídá hodnotě vlnové délky vašeho
absorpčního maxima, je zapotřebí ji opravit na vaši vlnovou délku.1
3.
Začněte sestrojovat závislosti hodnot koncentrace standardních přídavků na hodnotách
absorbance použitím tlačítka CALIBR dvakrát za sebou. Dostanete se do tabulky, kde
v prvním sloupci se uvádějí hodnoty koncentrací standardních přídavků a v druhém
sloupci se ukládají naměřené hodnoty absorbance. Při metodě standardních přídavků je
prvním bodem závislosti neznámý vzorek a dalšími body vzorek s přídavky.
4.
Po změření všech roztoku, připravených podle návodu, se tabulka uloží tlačítkem
ENTER. Poté se na obrazovce ukáže přímka.
5.
Pro váš další výpočet opište hodnoty F (převrácená hodnota směrnice přímky F=1/k) a
D (velikost úseku na ose absorbance).
UPOZORNĚNÍ! Přístroj obsluhujte přesně podle dále uvedeného návodu. Poruchu hlaste
ihned asistentovi. Při manipulaci s kyvetou ji držte za matné stěny a zacházejte s ní šetrně.
Kyvety zásadně uvnitř nevysušujte a nečistěte! Při plnění roztokem stačí, když kyvetu
několikrát (min. 3x) vypláchnete měřeným roztokem. Před vložením kyvety do kyvetového
prostoru osušte její vnější stěny a dno filtračním papírem, buničinou nebo jemným savým
hadříkem. Čistotu zkontrolujte prohlédnutím kyvety proti světlu. I slabě znečištěná okénka
(ulpěné kapky, otisky prstů) zkreslují hodnotu absorbance.
Činidla a roztoky
1.
Základní roztok 1,10-fenanthrolinu má přesnou koncentraci 0,01 mol l-1 a je připraven v
dávkovači 2 ml. Toto množství představuje dostatečný přebytek činidla tak, aby
komplexace s železnatým iontem proběhla kvantitativně.
2.
Octanový tlumivý roztok (pH = 4,5) o koncentraci 0,1 mol l-1 je připraven v dávkovači 5
ml. Tento zásobní roztok obsahuje též hydroxylamin (100 g l-1) pro redukci přítomného
Fe3+ na Fe2+.
3.
Standardní roztok železnaté soli o objemu 250 ml a o látkové koncentraci 5.10-4 mol l-1
připravíme navážením potřebného množství hexahydrátu síranu amonnoželeznatého
(Mohrovy soli) - Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O (M = 392,13 g mol-1) s přesností na 4 desetinná
místa. Navážené množství se rozpustí v malém množství destilované vody v 250 ml
odměrné baňce, válečkem se přidá 2,5 ml H2SO4, zředěné v poměru 1:10 (je připraven v
zásobní lahvi), roztok se doplní po značku a promíchá se. Koncentrovanou kyselinu
sírovou odměřujeme válečkem za použíti ochranných brýlí!
7
Vzorky
Každý student odevzdá 2 vypláchnuté (nemusí být suché) a označené odměrné baňky 50
ml, do kterých dostane vzorky.
Pracovní postup
1.
Absorpční spektrum komplexu
Do 25 ml odměrky se odměří 2 ml roztoku železnaté soli o koncentraci 5 · 10-4 moll,
přidá se 5 ml octanového tlumiče, 2 ml činidla o koncentraci 0,01 mol l-1, doplní se po
značku, promíchá a měří se závislost absorbance na vlnové délce v intervalu 400 až 600 nm.
2.
Zjištění časové stálosti komplexu
Do 25 ml odměrky se odměří 2 ml roztoku železnaté soli o koncentraci 5 · 10-4 mol l-1,
přidá se 5 ml octanového tlumiče, 2 ml činidla o koncentraci 0,01 mol l-1, doplní se po
značku, promíchá a ihned se měří absorbance při vlnové délce λmax. Absorbance se měří v
půlminutových intervalech po dobu 5 minut.
3.
Sestrojení kalibrační křivky
V sedmi 25 ml odměrkách připravíme řadu 7 roztoků se vzrůstajícim obsahem
standardního roztoku Mohrovy soli a se stejným množstvím octanového tlumiče a roztoku
fenanthrolinu:
Roztok
0
1
2
3
4
5
6
ml 5 · 10-4 mol l-1 Fe2+
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
ml octanový tlumič
do každé odměrné baňky 5 ml
ml 0.01 mol l-1 činidla
do každé odměrné baňky 2 ml
Odměrné baňky se doplní po značku, promíchají a měří se absorbance proti slepému
pokusu (složením odpovídá prvnímu roztoku neobsahujícímu Fe2+) při vlnové délce λmax.
Měrnou kyvetu je třeba vždy před měřenim alespoň 3x propláchnout roztokem, který chceme
měřit.
4.
Stanovení železa ve vzorku
Každý student do dvou označených odměrných baněk na 50 ml dostane neznámé
vzorky. Baňky se vzorky doplní destilovanou vodou po značku a důkladně promíchá, a
pak postupuje podle návodu:
8
a) pomocí kalibrační přímky
Pro orientační stanovení se odpipetuje do 25 ml odměrné baňky 1 ml vzorku, přidá se 5
ml octanového tlumiče a 2 ml fenanthrolinového činidla. Roztok se doplní po značku,
promíchá a změří se absorbance za přesně stejných podmínek, za jakých byla měřena
kalibrační křivka. Zásadou je, aby měřená hodnota absorbance ležela v rozsahu hodnot
kalibrační křivky.
Analýzu vzorku (pipetování, úprava a vlastní měření) opakujte nejméně 3 x ! Stejný
postup použijte u druhého vzorku.
Opište do sešitu hodnoty absorbance i odpovídající hodnoty koncentrace vypočtené
z kalibrační přímky. Průměr ze třech samostatných měření použijte pro výpočet hmotnostního
obsahu železa ve vzorcích pitné vody
b) standardní přídavek
Pro stanovení koncentrace metodou standardního přídavku pipetujeme takový objem
vzorku, aby odpovídající hodnota absorbance byla kolem 0,2. Připravíme pět roztoků, do
kterých se vedle tohoto objemu vzorku přidá postupně proměnné množství standardního
roztoku železnaté soli a stejné množství tlumiče a činidla:
Roztok
0
ml vzorku
ml 5 · 10-4 mol l-1 Fe2+
1
2
3
4
množství odpovídající A=0,2
0
0,5
1,0
1,5
ml octanový tlumič
do každé odměrné baňky 5 ml
ml 0.01 mol l-1 činidla
do každé odměrné baňky 2 ml
2,0
Roztoky se doplní po značku, promíchají a u všech změříme hodnotu absorbance proti
slepému pokusu.
Zpracování dat
1. Podle grafu absorpčního spektra vyznačte λmax.
2. Na základě Lambertova-Beerova zákona (viz vztah 4) a podle hodnoty absorbance při λmax
a koncentrace připraveného roztoku v baňce 25 ml vypočítejte hodnotu molárního
absorpčního koeficientu při dané vlnové délce ελ [l mol-1 cm-1]. .
3. Sledujte závislost absorbance na čase a v závěru protokolu diskutujte stálost komplexu.
4. Pro získání kalibrační křivky (závislosti absorbance na látkové koncentraci železa)
proložte experimentálními body přímku pomocí lineární regrese. Lambertův-Beerův
zákon odpovídá přímce procházející počátkem (viz vztah 4). Při experimentálním
uspořádání, kdy se měří rozdíl absorbancí kyvety s destilovanou vodou a kyvety se slepým
9
vzorkem (fenanthrolinové činidlo, octanový tlumič a voda), je třeba použít obecnou
rovnici přímky A=k.c+q
5. Pomocí získaných hodnot koncentrací vzorku z kalibrační přímky vypočítejte látkovou
koncentraci Fe. Pozor na to že na základě kalibrační přímky byly vyhodnoceny roztoky
připravené odpipetováním určitého objemu zásobního roztoku vzorku a jeho zředěním
na objem 25 ml, přičemž sám původní vzorek byl zředěn v baňce na objem 50 ml.
Z vypočtené koncentrace vzorku v 50 ml a určete celkovou hmotnost Fe (MFe=55,847 g
mol-1) ve vzorku (mg) pro oba neznámé vzorky. K výpočtu použijte buď programové
vybavení počítače v laboratoři nebo kalkulačku (má-li statistické funkce).
6. Pro metodu standardního přídavku použijte rovněž lineární regresi. Vstupními daty jsou
hodnoty F (převrácená hodnota směrnice přímky F=1/k); D (velikost úseku na ose
absorbance, který odpovídá absorbanci vzorku (D=Avz)
Tuto závislost lze popsat LAMBERTův-BEERův zákonem
Aλ = ελ b c = k · c = c/F = D
Ze získaných hodnot F a D (Avz) vypočítáme koncentraci vzorku c1 podle vztahu
c1 = Aλ /ελ b = Aλ / k = D · F
Z koncentrace vzorku c1 , známých objemu ředění (25 ml) a pipetovaného objemu lze
vypočítat látkovou koncentrace původního vzorku.
n1 (naředěné) [mol] = n2 (odebrané) [mol];
c1 · V1(řed) = c2 · V2 (pip)
Získanou koncentrace a celkový objem připraveného vzorku 50 ml použijte pro přepočet
na hmotnost železa ve vzorku.
URČENÍ
STECHIOMETRIE
KOMPLEXU
METODOU
KONTINUÁLNÍCH VARIACÍ (JOBOVA METODA)
Pro určení stechiometrie komplexu MLn má nejširší použití metoda kontinuálních
variací.
Metoda kontinuálních variací (Jobova metoda) je založena na měření absorbance roztoků
kovu (M) a ligandu (L), v nichž je součet celkových analytických koncentrací M a L stálý, tj.
c(M) + c(L) = m, ale mění se jejich poměr v závislosti na látkovém zlomku kovu x = c(M)/m.
V řadě roztoků se mění x od 0 do 1. Lze dokázat, že tato závislost má maximum v bodě n=(1x)/x.
Pro rovnovážné koncentrace kovu [M] a ligandu [L] platí (materiálová bilance):
[M] = c(M) - [MLn]
a
[L] = c(L) – n[MLn]
Vztah mezi [M], [L] a [MLn] je dán konstantou stability:
βn = [MLn] / ([M]· [L]n)
(6)
(7)
Dosazením rovnice (6) do (7) a úpravou lze získat vztah pro závislost rovnovážné koncentrace
komplexu na látkovém zlomku kovu:
10
[MLn] = βn (x m - [MLn]) {(1- x)m - n[MLn]}n
(8)
Pokud ionty kovu a ligandu, na rozdíl od komplexu, při zvolené vlnové délce neabsorbují, lze
vypočítat n z hodnoty x odpovídající maximu závislosti absorbance A na x, a hodnotu
koncentrace komplexu v bodě maxima z Lambertův-Beerova zákona, protože platí, že
Aλ = ελ·[MLn]·b
Ve skutečnosti vždy měříme koncentraci komplexu, ovšem při přebytku činidla platí, že
koncentrace komplexu je rovna koncentraci železa.
Metoda kontinuálních variací je vhodná i pro relativně slabé komplexy, tj. komplexy s malou
hodnotou konstanty stability. Pro n > 3 jsou však výsledky této metody nejisté. Samozřejmě ji
nelze použít v případě, kdy se za daných podmínek tvoří více než jeden komplex.
Činidla a roztoky
1.
2.
3.
Standardní roztok železnaté soli o látkové koncentraci 5 · 10-4 mol l-1
Ze základního roztoku 1,10-fenanthrolinu o koncentraci 0,01 mol l-1 se připraví 1,10fenanthrolin o koncentraci 5 · 10-4 mol l-1 zředěním destilovanou vodou do odměrné
baňky objemu 100 ml
Tlumivý roztok octanu sodného a kyseliny octové o koncentraci 0,1 mol l-1 (obsahuje
hydrochlorid hydroxylaminu, který redukuje Fe3+ na Fe2+).
Pracovní postup k určení stechiometrie komplexu metodou kontinuálních variací
Pozor!!! V této úloze se používá roztok o koncentraci 1,10-fenanthrolinu 5 · 10-4 mol l-1.
Nezaměňujte jej s roztokem 0,01 mol l-1.
V deseti 25 ml odměrných baňkách se přesně připraví roztoky podle následující tabulky
ml 5 · 10-4 mol l-1 Fe2+
0
0,5
1,0
ml octanový tlumič
ml 5 · 10-4 mol l-1 činidla
1,5
2,0
2,5
3,0
5,0
8,0
10,0
2,0
0
do každé odměrné baňky 5 ml
10,0 9,5
9,0
8,5
8,0
7,5
7,0
5,0
Po doplnění po značku destilovanou vodou a promíchání, se měří po 5 min. absorbance při
vlnové délce λmax
Zpracování dat k určení stechiometrie komplexu metodou kontinuálních variací
Do grafu vyneste absorbanci proti látkovému zlomku železa xFe = ml Fe2+/10. Extrapolací
přímkových větví určete jejich průsečík, spuštění kolmice udá x, z něhož se vypočte počet
ligandů n=(1- x)/x
Z experimentálních hodnot vypočtěte dále konstantu stability β(MLn) pomocí rovnic
uvedených výše. Hodnotu A(MLn) odečtete z maxima závislosti A = f(x).
11
1.
Z hodnoty Aλ pro roztok se známou [MLn] odečtete ελ, je-li b = 1cm.
2.
Z hodnoty A(MLn) vypočtěte hodnotu [MLn] pro váš neznámý roztok.
3.
Spočítejte hodnoty celkové koncentrace ligandu (1,10-fenanthrolinu), a celkové
koncentrace kovu (Fe2+) v roztoku odpovídající největší hodnotě absorbance.
4.
Podle vztahu (6) vypočtěte hodnoty [M], [Ln].
5.
Podle vztahu (7) vypočtěte konstantu stability β(MLn).
Protokol
Protokol obsahuje jednoduše vyjádřený princip práce, úkoly a přehledným způsobem
zpracované výsledky včetně navážek a příkladů výpočtů. V závěru protokolu budou stručně a
přehledně sestaveny nalezené výsledky, tj. λmax, ελmax (vypočtěte ze směrnice kalibrační
přímky a tloušťky kyvety) komplexu železa s 1,10-fenanthrolinem a hmotnosti železa
v dodaných vzorcích v mg stanovené jak metodou kalibrační přímky, tak metodou
standardního přídavku.
Kontrolní otázky
1.
Formulujte Bohrovu frekvenční podmínku.
2.
Které energetické přechody jsou excitovány absorpcí ultrafialového a viditelného
záření?
3.
Vymezte ultrafialovou a viditelnou oblast záření v nm?
4.
Vyjmenujte čtyři základní části jednopaprskového spektrofotometru. Popište jednotlivé
části a jejich funkci?
5.
Co je to transmitance, absorbance a jak jsou definovány?
6.
Co je to absorpční spektrum. Jaké veličiny a v jakých jednotkách jsou v absorpčním
spektru vynášeny na osy?
7.
Co vyjadřuje Lambertův-Beerův zákon?
8.
Vymezte podmínky platnosti Lambertůva-Beerůva zákona.
9.
Které veličiny v Lambertůvě-Beerůvě zákoně závisí na vlnové délce?
10.
Jaký význam má pro fotometrii měření časové stálosti komplexu?
11.
Co je to kalibrační křivka a jaký má význam pro fotometrické stanovení?
12.
Na čem je založena metoda standardního přídavku a v čem spočívá její výhoda?
13.
Popište princip metody kontinuálních variací.
14.
Jak se určuje stechiometrie komplexu podle Jobovy metody?
15.
Co je to konstanta stability komplexu a jak charakterizuje komplex?
12