1 Přístrojové zajištění derivatizačních a detekčních metod Většina

1
Přístrojové zajištění derivatizačních a detekčních metod
Většina derivatizačních reakcí – v kapalném fázi (homogenní prostředí) často v tzv.
reaktoru (standardizované) např. Pico-Tag
čistě chemické reakce (viz předchozí), také der. postupy
zprostředkované enzymatickou reakci
před- a post-kolonová reakce
je-li derivatizační reaktor stabilní součástí chromatografu, označuje se spojení „on-line“ x
„off-line“ alespoň výhledově se bude použití on-line metod stále více rozšiřovat, i když samozřejmě
jejich použití není univerzální. Asi největší překážkou k jejich většímu využití je přístrojová
náročnost a samozřejmě cena. Z hlediska přípravy vzorku vyžadují mnohem menší objemy vzorků,
na druhou stranu však nejsou všechny v současnosti používané techniky vhodné k těmto účelům
(např. extrakce kapalina-kapalina). Materiály pro on-line kombinaci bývají dražší, na druhou stranu
jsou nižší náklady na chemikálie, např. rozpouštědla a výhodnější je menší časová náročnost.
Předkolonová derivatizace
off-line
umožňuje drastické podmínky; není časové omezení; nemusí být 100%, ale
reprodukovatelná; derivatizační činidlo mísitelné s mob. fází nebo odstranit =
rozpustný pouze analyzovaný produkt; off-line lze použít ke zvýšení
hydrofobicity a tím z hydrofilní matrice izolovat analyty, jež jsou předmětem
zájmu, snadněji než bez derivatizace
on-line
podmínky a) der. činidla v mob. fázi netěkavá a chemicky stálá
b) vznikající produkty rozpustné v mob. fázi
c) musí probíhat v malém objemu
d) relativně rychlé
výhody: menší množství vzorku
nevýhoda: všechny složky systému, tj. derivatizační reagencie,
rozpouštědla a všechny produkty rozpustné v dané
mobilní fázi a eluovatelné daným analytickým systémem
Postkolonová derivatizce
off-line zřídka používané – jímání frakcí, obtížná automatizace (stanovení fosfátu
ve fosfolipidech). Bohužel k tomuto systému off-line jsme velmi
často tlačeni přístrojovou dostupností (např. MALDI, ale i NMR
atd.)
on-line v současnosti nejběžnější spřažení metod (viz dále); tyto kombinace
zachovávají separační účinnost použité analytické metody, kterou
jinak velmi potlačíme systémem off-line (sběrem frakcí)
Derivatizace biol. vzorků v homogenním prostředí – problematická (tvorba sraženin) = úprava před
analýzou (viz předchozí přednáška) nebo derivatizace na pevné fázi (zakotvena na nosiči)
Výhody:
Postkolonové reaktory
1. použít publikované separační postupy
2. vznik vedlejších produktů není tak závažný jako u předkolonové derivatizace
3. reakce nemusí probíhat kvantitativně a reakční produkty nemusí být stálé. Reakce
ale musí být reprodukovatelná, potřebujeme 2. čerpadlo
2
A) Otevřený tubulární reaktor
Nejjednodušší – trubička (skleněná, křemenná, nerez. ocel, polytetrafluoroethylen – PTFE) stočená
do kruhu nebo podobně, ještě lepší spirálně stočený. Rychlé reakce (do 1 min), při použití
„spletených“ reaktorů (spletená vlákna) až několik minut
B) Náplňové reaktory
trubice z nerez. oceli plněná nosičem (většinou skleněné perličky 10-15 µm), reakční doba 0,5-4
min). Dnes: spíše aktivní nosič než inertní materiál – ionexy, redoxní činidla, nosiče obohacené
katalyzátorem nebo nosiče s imobilizovanými enzymy = označ. reaktory s tuhou fází
C) Reaktory se segmentovaným tokem
v analyzátorech s kontinuálním průtokem (1969 - AA) Přerušení, segmentace, sloupce protékající
kapaliny vzduchem nebo inertním plynem brání difůzi separované zóny. K segmentaci lze také
použít nemísitelné kapaliny (voda-organika).
2 nejdůl. faktory ovlivňující účinnost reaktoru jsou smáčivost stěny a segmentační frekvence. Lze
využít reakce probíhající až desítky minut
použití v praxi zejména tam, kde fungují jako extrakční soustava
velkou pozornost výběru rozpouštědel – smáčivost trubice má velký význam na účinnost zařízení
před vstupem do detektoru je třeba odstranit segmenty plynu (org. kapaliny) – T separátory –
využívají rozdílné povrchové smáčivosti různých materiálů (PTFE-sklo; vatička PTFE)
membránové separátory – nejdřív PTFE membrána, nyní sendvič (střední část z PTFE, obě sousední
z oceli)
D) Reaktory z porézních a dutých vláken
odstraňují problém vznikající z nedokonalého mísení efluentu s reagenciemi, minimální příspěvek k
rozšíření separovaných zón
vlákna (trubičky) ze spletených PTFE vláken v nádobce plněné vhodným činidlem (např. alkalizace
NaOH — konverze na UV absorbující produkty)
E) Fotochemické reaktory
nefluoreskující na fluoreskující nebo elektroaktivní produkty
kapilára – křemenná, temperovaná (teplotní fluktuace – reakční kinetika)
F) Zdvojené reaktory
každý reaktor na jiném principu
1
– ohřátím k hydrolýze
2
– ozářením na fluoreskující produkty
G) Enzymové reaktory
zakotvená fáze na nosičích (agarosa, celulóza, polyakrylamid, sklo, silikagel) nejobvyklejší – úprava
povrchu nosiče aminopropylem a následná aktivace glutaraldehydem, pak se koordinuje enzym jako
ligand
Aplikace
zásadně rychlé reakce
3
Redoxní reakce – pro elekrochemickou detekci (amperometrie, coulometrie, potenciometrie) nebo
pro přímé převedení analytu na fluoreskující sloučeninu
vitamin K — redukcí vyniká hydrochinon (flourimetricky)
postkolonová generace jodu nebo bromu – I nebo Br reagují se separovanými látkami a přebytek
halogenu je detekován amperometricky
často používána je postkolonová oxidace vedoucí ke vzniku fluoreskujících produktů
aminocukry – redukční vlastnosti, např. redukují měďnatou sůl bis(1,10-fenanthrolinu), vzniklý
bis(1,10-fenanthrolin) měďný se amperometricky reooxiduje na Ag/AgCl elektrodě
Hydrolytické reakce
např. kortisol na fluoreskující produkty účinkem HCl
Chemiluminiscenční reakce
citlivé a selektivní stanovení řady látek vázaných (hydrofobně) na bílkoviny nebo fosfolipidy
3 systémy využívající: 1) deriváty kys. šťavelové (peroxyoxalátová), 2) lucigenin, 3) luminol
Termálně iniciované reakce
AA – ninhydrin
Komplexotvorné reakce
pomalé = málo rozšířené nepřímá fluormetrie iontů kovů (viz následující přednáška o
stanovení kovů
Postkolonové on-line derivatizační reakce
viz tab.
Enzymové reakce
Imobilizované enzymy (předkolonové úpravy), např. β-glukoronidáza k analýze estriolových
glukuronidů → produkt estriol
4
Detektory
Absorbance
molární extinkční koeficient je specifický pro každou molekulu
UV cutoff – sole a aditiva – zvýšení vlnové délky a absorbance
a) fixní vlnová délka
b) variabilní vlnová délka
c) skenující (rychle skenující – 10-20x /s)
d) photodiode array (výhoda – spektrum, obr.)
výhody – vysoká citlivost, selektivita X univerzálnost (200 nm),
nízké pozadí – umožňuje gradientovou eluci,
nedestruktivní, snadné
nevýhody – analys musí absorbovat, vln. délka ne pod cutoff,
odpověď je rozdílná pro jednotlivé látky
Index lomu (Refractive Index)
porovnává index lomu čisté mobilní fáze s fází obsahující analyt; může být positivní i negativní
3 způsoby: deflekce (ohyb), Fresnel odraz a interference
deflekce – měří difrakci (ohyb) světelného paprsku procházejícího skrz celu
Fresnel odraz – měří intenzitu odraženého paprsku na rozhraní kapaliny a skleněného bloku. Dva
světelné paprsky prochází skleněným hranolem a pak jdou do dvou foto cel (referenční a vzorková),
detektor měří rozdíly mezi jejich ohybem světla
interferometrický design – využívá spliterů (štěpení) k rozdělení paprsku před vzorkovou a referenční
celou a jeho znovu-spojení při detekci. Jestliže je rozdíl v jejich obsahu – rozdíl v optické délce
- může být konstruktivní nebo destruktivní
Aplikace: size-exclusion chromatography (izokrat. separace), polymery a proteiny, cukry. Skoro pro
všechny látky (mimo ty, které mají index lomu podobný jako mob. fáze), nedestruktivní, střední
citlivost – vhodné pro preparativní chromatografii, změna s teplotou (změna hustoty), zpětný tlak
rovněž mění hustotu
Fluorescenční
přirozená fluor. – benzen a deriváty (bílkoviny – tryptofan, tyrosin – jako UV) absorbuje energii ve
specifické vlnové délce (excitační), dosahuje excitovaný stav a pak se vrací do původního stavu
emisí světla při delší vln. délce (emisní λ)
Vysoká selektivita (2 vln. délky) a citlivost (laser !!!!) hlavní nevýhoda- rozdílné vln. délky pro
každou látku, derivatizace
Elektrochemické detektory – měří elektrická data z roztoků pomocí 2 elektrod
Amperometrické
nejčastější pod názvem amperometrická detekce, kdy vzorek prochází elektrolytickou reakcí - po
aplikaci konstatního napětí je měřen výsledný proud v čase. Pro látky které jsou snadno oxidovatelné
nebo redukovatelné (aromatické aminy a fenoly)
extrémně selektivní – pouze molekula, která je oxidovatelná nebo redukovatelná pracovní napětím
může být detekována
mob. fáze – elektrochemicky inertní, disociovatelný elektrolyt
5
vysoká citlivost
modifikace – pulzní amperometrie
Coulometric (voltametrický)
modifikace amper., totální konverze všech molekul reakcí – způsobeno velkou pórezní
grafitovou pracovní elektrodou nebo pomalým průtokem mob. fáze; citliva metoda, ale
produkuje mnoho šumu = limita detekce obdobná
Vodivostní detekce
elchem. detekce k detekci iontů. Roztok bohatý na ionty je lepší vodič proudu než roztok málo ionty.
Konstantní napětí v cele detektoru a měří se proud v čase.
Hlavně pro analýzu organických a anorganických iontů eluovaných z iontově-výměnných kolon.
Citlivé, ale neselektivní
Aplikace: katecholaminy
Radioaktivní
pevná nebo průtoková cela (scintilační koktejl)
Rozptyl světla
Mnohaúhlový rozptyl laserového světla (Multi-Angle Laser Light Scattering Detector)
interakce světla a hmoty když světlo udeří do hmoty, způsobí dočasný dipól v molekule který
osciluje ve frekvenci dopadajícího světla. Když se molekula vrací do původního stavu, emituje světlo
v různých směrech
Celkový rozptyl světla je přímo úměrný molek. hmotnosti a koncentraci (software – v sérii s UV či
RI k určení koncentrace)
Určení Mw větší než 10.000 (není přesné pro menší než 5.000)
Evaporative Light Scattering (odpařovací rozptyl světla)
univerzální detektor, k detekci všech látek méně těkavých než mob. fáze
výtok z kolony – zmlžen (nebulizován), vytvořena jednotná mlha která je zahřáta k odstranění
těkavého rozpouštědla
netěkavý analyt prochází skrz celu, kde rozptýlí paprsek ze zdroje světla
Aplikace: cukry, lipidy (x jiné metody); kompatibilita s gradientem
výhody: univerzálnost, gradient, nezávislý na teplotě
nelineární kalibrační křivka
Corona – Detekce nabitého aerosolu (Charged Aerosol Detector)
Měření náboje spojeného s částicí analytu. Náboj je v přímém poměru k množství analytu ve vzorku.
Detekce netěkavých analytů včetně těch bez chromoforu. Odpověď detektoru nezávisí na optických
vlastnostech analytu (jako u UV/VIS detekce) nebo ionizovatelnosti (jako u MS – hmotnostní
spektrometrie)
Postup:
1) Přeměna analytu na částice (rozprášení, odpaření rozpouštědla)
2) Proud kladně nabitého plynu se srazí s částicemi analytu – náboj je přenesen na částice (větší
částice, větší náboj); náboj získá plyn (N2) průchodem skrz vysokonapěťový platinový
korónový nabíječ (corona charger)
6
3) Částice jsou převedeny do kolektoru kde je změřen vysoce citlivým elektrometrem.
Alternativa k ostatním detektorům (hlavně netěkavé analyty: od lipidů po proteiny, DNA,
oligosaccharidy, aminokyseliny, cukry, léčiva, ba i ionty),
Univerzální detektor, citlivost až pikogramy.
Nepřímá detekce
princip – fyzikální náhrada přidávané, dobře detekovatelné složky (chromoforu, fluoroforu nebo
iontu) sledovaným analytem.
Nejjednodušším mechanismem je zředění mobilní fáze vstupujícím analytem
Univerzálnost
nepřímá UV – nejběžnější; do mobilní fáze se přidává UV-aktivní látka -proba fig 4.1
smysl zobrazení píků je určován druhem anal. vzorku. Analyty, které nenesou žádný náboj a nebo
mají stejný náboj jako proba – negativní píky, nenabité analyty – poskytují positivní píky, pokud jsou
tak polární, že se eluují před systémovým píkem – obr. 4.2
Smysl píku závisí na náboji solutu a jeho retenci relativně k použité probě a je nezávislý na množství
dávkované látky (obr. 4.3, tab. 4.1)
Pokud má analyzovaný solut podobné detekční vlastnosti jako přidaná proba – výsledek je součet
detek. vlastností proby a solutu (DOPA, dihydroxyfenylalanin – obr. 4.4)
Volba složek – aby sledovaný analyt byl eluován v těsné blízkosti proby (docílíme jak změnou
koncentrace použité proby, tak změna hydrofobních vlastností tuhé fáze (čím vyšší obsah alkylů v
solutu, tím hydrofobnější musí být proba a tím méně hydrofobní musí být adsorbent)
CE: kationty – (nízké pH) imidazol, N,N-dimethyl benzylamin, on-column chelatace
(hydroxymáselná kys.)
anionty – obrátit EOF – chromát, pyromelitat, benzoát, naftyl sulfonát
Spřažené techniky
spřažené techniky – kombinace separačního potupu s technikou založenou na zcela odlišném
principu nebo kombinace dvou a více separačních technik – důležitost multi*dimenzionálnosti
Hmotnostní detektor
hmotnostní detektor – univerzální, strukturální informace, interface k HPLC, nyní za atmosférického
tlaku - účely:
1) přeměnit analyt v roztoku na ionty v plynné fázi (ESI, APCI i APPI) – produkuje
ionty za atmosférického tlaku; rozdíl – jak jsou ionty tvořeny
2) odstranění HPLC rozpouštědla; k zamezení kolizí iontu analytu s rozpouštědlem – vakum
(typicky 10-5 torru); jakmile je iont vytvořen – ionty v mobilní fázi dopraveny do MS skrz
kapiláru a sérii clon, které redukují tlak systému; ionty jsou filtrovány a detekovány na
základě poměru hmota k náboji
Ionizace elektrosprejem
produkce iontů začíná s nabitými polárními analyty v HPLC rozpouštědle. LC eluent je rozprášen
7
(nebulizován) do komory za atmosférického tlaku v přítomnosti silného elektrostatického pole a
vyhřátého sušícího plynu. Eluent — špička jehly — vysoké napětí a tlak proudu plynu — aerosol
nabitých kapének; odpařování — nabitý analyt migruje k povrchu, kapénka exploduje — menší
nabité kapénky; když aerosol analytu dosáhne kritického rozměru (10 nm) — ionty analytu vytrženy
z kapénky do plyné fáze; tyto ionty jsou přitahovány a prochází skrz kapiláru do hmotnostního
analyzátoru Vhodnost: velké biomolekuly (proteiny, peptidy, oligonukleotidy); mají často více než 1
náboj, proto lze analyzovat až 150 000 (3000 m/z)
Chemická ionizace
x ESI tvoří ionty v plynné fázi (spíš než v HPLC eluentu) — analyt musí mít určitou těkavost. HPLC
eluent je zmlžen ve vyhřívané komoře (analyt i solvent vypařen); korónový výboj ionizuje páry
rozpouštědla („vybíjené“ elektrony) — ionty rozpouštědla předají náboj molekulám analytu
chemickými reakcemi (chemická ionizace)
Vhodnost: široká oblast polárních a nepol. látek, Mw menší než 1.500, ne pro nestabilní látky,
normal-phase HPLC, protože většinou nepolární látky
Fotoionizace
Relativně nová metoda, jako při APCI – „vybíjecí“ lampa produkuje fotony v úzké oblasti
ionizačních energií (opatrně zvolena k ionizaci co největšího množství molekul analytu a přitom k
minimalizaci ionizace molekul rozpouštědla) — vzniklé ionty jdou skrz kapiláru do hmotn.
analyzátoru
Možnosti uspořádání ESI
Pufry a mobilní fáze
Detektory
Quadrupól
4 paralení tyče ve čtverci; ionty analytu jdou skrz; napětí na tyče generuje elektromagnetické pole –
toto pole určuje, který poměr hmota/náboj iontů projde filtrem v daném čase, nejjednodušší a
nejlevnější
2 módy: scan a SIM
Time-of-flight
stejná elektromagnet. síla je aplikována na všechny ionty ve stejném čase, udělí jim akceleraci k letu
dolů trubicí; lehčí ionty cestují rychleji a dosáhnou detektor první – poměry hmota/náboj iontů jsou
určeny dle „času příletu“
široké hmotnostní spektrum, přesné stanovení
Iontová past z kruhové elektrody a dvou uzávěrů = dohromady komůrka; ionty vstupující do
komůrky jsou chyceny elektromagnetickým polem. Jiné pole může být aplikováno k selektivnímu
vypuštění iontů z pasti.
Výhoda – může sloužit k mnohonásobné hmot. detekci bez dalšího hmotnostního analyzátoru
Jiná spřažení: s ICP-MS (inductively coupled), AAS, AES, NMR atd, ale i SPE, mikrodialýza …
8
GC detekce
MS
FTIR infračervená spektroskopie (Fourierova transformace); složky separované GC postupují do
světelné trubice kde absorbují infračervené záření vycházející ze zdroje; Fourierova
transformace interferogramu poskytuje IR spektrum, které lze použít jak k detekci dané látky,
tak k její identifikaci, příp. určení čistoty
FID flame ionization detection
plamenový ionizační detektor
ECD electron-capture
elektron zachycení
FPD flame photometric det.
plamenový fotometr
NPD nitrogen phosphorus det.
(dusík fosfor detekce)
TCD thermal conductivity det.
(tepelně vodivostní det.)
MALDI-MS (Matrix –assisted laser desorption/ionization /TOF time-of-flight
makromolekulární látky jsou uloženy do lože nízkomolekulární matrice (značný přebytek, látky
schopny absorbovat světlo laserového paprsku). Po krátkém ozáření laserem dochází k iradiaci
vzorku a k současné desorpci a ionizaci sledované látky, která vykazuje minimální nebo žádnou
absorpci při vlnové délce použitého laseru
peptidy, proteiny, nukl. kys., glykokonjugáty bílkovin – matrice: kys. hydroxyskořicová