Nastavení metod pro imunofenotypizaci krevních buněk

Nastavení metod
pro imunofenotypizaci krevních
buněk pomocí průtokové cytometrie
Martin Špryngar
EXBIO Praha, a.s.
Obsah:
Porovnání vícebarevné vs. dvoubarevné cytometrie
Požadavky průtokové cytometrie na vybavení laboratoře
Zpracování vzorků
Vytváření panelů pro vícebarevnou průtokovou cytometrii
Nastavení cytometrů, standartizace
Návaznost kroků vyšetření periferní krve
pomocí průtokového cytometru
Preanalytická
fáze
Analýza
Postanalytická
fáze
Cíl nastavení metod imunofenotypizace krevních buněk
Účel naměřených dat
Požadavky množství měřených vzorků a na rychlost
zpracování výsledků
Požadavky na kvalitu měření a analytickou robustnost
metod
Požadavky na certifikaci
Cíl nastavení metod imunofenotypizace krevních buněk
+
lze sledovat specifické populace definované velkým množstvím
parametrů
-
pouze základní populace lymfocytů
+
lze součastně analyzovat několik populací buněk v jedné
zkumavce
-
pro podrobnější analýzu je potřeba velké množství
zkumavek
Dvoubarevná / tříbarevná průtoková
cytometrie
Vícebarevná průtoková cytometrie
-
nároky na nákup průtokového cytometru
+
i na jednoduchých průtokových cytometrech
-
servis průtokového cytometru
+
některé jednoduché typy průtokových cytometrů mají menší
nároky na servis
-
nároky na standardizaci měření
+
stačí i základní kontrola kvality měření
-
složitější analýza naměřených dat
+
jednoduchá interpretace naměřených dat
-
větší nároky na použité protilátky (problém získat single
reagencie), stabilita konjugátů s tandemovými fluorochromy
+
v FITC a PE je většina protilátek pro FC, konjugáty mají
dobrou stabilitu
Vícebarevná průtoková cytometrie
BD Biosciences
Vstupy pro imunofenotypizaci krevních buněk
Materiály pro imunofenotypizaci krevních buněk
Protilátky (vč. izotypových kontrol, sekundární prot.)
Lyzační, fixační a permeabilizační činidla
Provozní tekutiny pro FC
Kalibrační kuličky
Zkumavky
Laboratorní pomůcky
Ostatní procesy při imunofenotypizaci krevních buněk
Doprava a příjem vzorků krve
Uchovávání vzorků krve
Zpracování a značení vzorků krve
Měření
Likvidace odpadů
Ostatní procesy při imunofenotypizaci krevních buněk
Zpracování naměřených dat
Kalibrace cytometrů
Pravidelná údržba cytometrů
Servis – pravidelný vs. urgentní
Interní kontrola kvality
Externí kontrola kvality
Prostředí
Práce s potencionálně infekčním materiálem
- zkumavky, špičky, jehly
- aerosol – centrifugace, transfer tekutin
Práce s toxickými chemikáliemi
Možná kontaminace z dalších testů, které probíhají na
jednom průtokovém cytometru
Vysoké napětí a laser – u sorterů
Uživatelé
Základní zaškolení uživatelů
Průběžné školení uživatelů
Pravidla pro použití cytometrů, SOP
Průtokové cytometry
Průtokové cytometry
- vlastní
- cytometr v servisní laboratoři
- stroje v reagenčním leasingu
Průtokové cytometry
- hydrodynamická fokusace
- kapilární
- ultrasonická fokusace
Průtokové cytometry
- analogové
- digitální
Průtokové cytometry
- sample loader
- HTS
Průtokové cytometry
Průtokové cytometry vícelaserové
- s oddělenou optikou pro
jednotlivé
lasery
- se společnou optikou pro
červený a
modrý laser
Průtokové cytometry
- uzavřené systémy
- výzkumné zařízení
Další zařízení
- lyzační stanice
- centrifugy
- PC + vyhodnocovací sw
Průtokové cytometry
Dvoubarevné značení
Čtyřbarevné značení
- čtyřbarevný cytometr ≠
ideální nástroj pro
čtyřbarevné značení
Vícebarevné značení
- nároky na standardizaci a
stabilitu cytometru
Příprava vzorků
V návaznosti na požadavky certifikace měření a na status
protilátek CE IVD / RUO / ASR
Příprava vzorků
Povrchové značení buněk
- metody Stain-Lyse-Wash
Lyze erytrocytů
- osmotická lyze
- narušení membrán formaldehydem
- zvýšení osmotického tlaku přítomností
amonných iontů
- odstranění erytrocytů fyzikálními
metodami (+ další metody: aktivace,
proliferace)
Příprava vzorků
Intracelulární značení
buněk
-
cytoplasmatické
markery
-
jaderné markery
Blokování transportu
proteinů
Blokování nespecifických
vazebných míst
Izotypová kontrola
Fluorescence
BD Biosciences
Fluorescence
Počet lymfocytů CD79b FITC ≠ CD79b PE
Fluorescence
-
BD Biosciences
Přesvit fluorochromů na vašem cytometru
Vytváření panelů protilátek
Kompenzace + data spead
Vytváření panelů protilátek
Vytváření panelů protilátek
Vytváření
panelů
protilátek
Vytváření panelů protilátek
Validace panelů:
- FMO kontroly
- stabilizované definované vzorky krve (SEKK, ImmunoTrol)
- vzorky pozitivních buněk z jiných tkání nebo tkáňových linií
- stimulované buňky
Standardizace
Poznej svůj cytometr (lasery, filtry,…)
Udržuj cytometr v optimální kondici
Konfigurace cytometru, baseline (charakterizace cytometru)
Definice cílových hodnot MFI – vlastní nebo „standardní“ (EuroFlow)
„Standard“ – kuličky (CS&T, FlowSet, 8-peak Rainbow,…)
Nastavení cytometru (set up) – optimalizace pro konkrétní aplikace
Udržení daného nastavení v čase
Standardizace: baseline
= min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu
Baseline definuje okno pro optimalizaci
PMTV pro konkrétní aplikaci (setup)
šum
Standardizace
Zajištění reprodukovatelnosti měřených dat změnou PMTV
Automaticky - Platformy výrobců
(CS&T, FlowCheck+FlowSet)
Manuálně – „monitoring“ na jiných kalibračních
kuličkách
Data změřená dnes stejně jako za týden, měsíc, rok…
= porovnatelná data v dlouhodobém horizontu
Standardizace
Spherotech Rainbow Beads (8 peaks)
Závěr
Při zavádění nových metod je potřeba zohlednit všechny
návazné procesy
U vícebarevné cytometrie – modelování značení na daném
cytometru před zavedením značení
Validace značení pomocí dostupných kontrol
Bez kalibrace není vícebarevná průtoková cytometrie
Děkuji za pozornost