Srovnal - Význam minimální reziduální choroby u solidních nádorů

Význam minimální reziduální choroby
u solidních nádorů
MUDr. Josef Srovnal
Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc
Olomouc 14. 4. 2010
Minimální reziduální choroba
u pacientů se solidními tumory
•
značí přítomnost izolovaných, zbytkových
nádorových buněk v těle pacienta, u něhož byla
provedena radikální resekce primárního tumoru a
který je bez známek onemocnění
•
prekurzory mikrometastáz – zdroj recidivy
•
nejasný prognostický význam
(Wei He, PNAS 2007)
Metody detekce minimální reziduální
choroby
Detekce minimální reziduální choroby (minimal residual
disease – MRD) u solidních tumorů molekulárními
metodami znamená detekci znaků epiteliálních nádorových
buněk v kompartmentech mesenchymálního původu.
• Imunohistochemie – citlivost 1:10 000
• Průtoková cytometrie – citlivost 1: 100 000
• PCR – citlivost 1: 1 000 000
• Real time RT-PCR – citlivost až 1: 10 000 000
Markery buněk epiteliálních tumorů
pro detekci MRD
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Karcinoembryonální antigen
Cytokeratiny (CK 19, CK 20)
EGFR, EGFRvIII
Mamaglobin MGB1
EpCAM
TTF1
Tyrozináza
Mucin
Reference gene - GAPDH
Karcinoembryonální antigen
•
membránový glykoprotein uvolňující se do cirkulace,
sérová hladina má prognostický význam při sledování
pacientů s kolorektálním karcinomem, včasné odhalení
relapsu onemocnění (limit 5ng/ml) (imunoanalýza)
•
patří do velké CEA rodiny blízké imunoglobulinům
Human CEA family members
CEACAM1-8
•
zvýšeně exprimován ve více
než 95% nádorů GIT,
70% NSCLC,
50% nádorů prsu
N
N
A1
S
S
B1
S
S
A2
S
S
N
A1
S
S
B2
S
S
B
S
S
A3
S
S
A
S
S
A2
S
S
B3
S
S
B
S
S
N
N
N
N
A
S
S
A
S
S
B
S
S
CEACAM1 CEACAM3 CEACAM4 CEACAM5 CEACAM6 CEACAM7 CEACAM8
Cytokeratin 20
•
cytokeratiny tvoří největší podskupinu
proteinů intermediálních filament cytoskeletu
epiteliálních buněk, do které patří 20 členů s
podobnou strukturou a velikostí
•
jejich primární funkcí je chránit buňky před
mechanickým poškozením a hrají úlohu v
oblasti buněčné signalizce a apoptózy
•
cytokeratin 20 je vysoce specificky
exprimován v epiteliálních buňkách
gastrointestinálního traktu
(Molecular Biology of the Cell, Alberts)
Mamaglobin 1 (SCGB2A)
je vysoce glykosylovaný protein o nízké molekulární hmotnosti
(10,5kD), patřící do rodiny sekretoglobinů, avšak jeho
biologická funkce zůstává zatím neznáma.
Gen je lokalizován na chromozómu11q13
Díky téměř výlučné expresi u nádorů
prsu, je mamaglobin jako antigen
zajímavý i z pohledu specifické
imunoterapie
Od roku 2000 byl mamaglobin použit
ve více než 50 studiích zabývajících se
MRD u pacientek s karcinomem prsu
Metodika detekce MRD
Transport - vzorky SK nebo KD (V=10, resp. 5ml)
transportované v EDTA, Pax Gene zkumavkách,
vzorky tkáně v RNA Later (stabilizace RNA,
inhibice RNáz)
Izolace RNA - izolovaná z cca 11 miliónů jaderných
buněk krve nebo dřeně a z 20-40mg tkáně
metodou dle Chomczynského (Tri-reagent, MRC)
Transkripce – 3 µg RNA/30 µl reakční směsi s
použitím random primerů, H minus M-MuLV
reverzní transkriptázy (Fermentas)
Real time RT-PCR – reakční směs (25 µl) obsahuje
specifické primery, TaqMan sondu, 100 ng cDNA.
Kvantifikace dle standardizační křivky (standardyplazmidová DNA)
Real-time RT PCR záznam
Cíle studie
1. zavést a zoptimalizovat metodiku detekce
minimální reziduální choroby u solidních nádorů
2. stanovit prognostický význam přítomnosti
minimální reziduální choroby v krvi, kostní dřeni
a lymfatických uzlinách pacientů se solidními
nádory, zejména s karcinomem prsu a kolorekta
3. určit míru nezávislosti reziduální choroby jako
prognostického faktoru
Prognostický význam MRD u
pacientů s kolorektálním
karcinomem
Vzorky
•
182 pacientů operovaných pro kolorektální karcinom ve
FN Olomouc v letech 2003 - 2008
Odběry:
1. Systémová krev a kostní dřeň
2. Peroperačně a jeden měsíc po operaci
3. Tkáň tumoru
•
Markery:
•
1. mRNA CEA, CK 20
2. Sérové hladiny onkomarkerů CEA a CA 19-9
3. k-ras, MSI
Charakteristika souboru
Sex
Mean age at
diagnosis
(years) 95%CI
Grading
Mean OS
Mean DFS
(months) 95% CI (months) 95%CI
Diagnosis
S_CEA
S_CA 19-9
Female
/ Male
1
41
19/22
65,4 (62,0; 68,8) 22,2 (17,8; 26,6) 21,0 (16,7; 25,23) 7 23 3
22
19
8 /40 (20,0) 7/28 (25,0)
2
59
22/37
63,0 (60,2; 65,8) 20,4 (16,9; 24)
19,0 (15,5; 22,4)
4 33 10
40
19
16/51 (31,4) 14/47 (29,8)
3
47
12/35
64,9 (61,8; 68,1) 27,0 (23,1; 31)
24,6 (20,8; 28,5)
4 26 7
32
15
9/41 (22,0) 6/35 (17,1)
4
32
15/17
66,4 (61,9; 69,4) 15,3 (10,3; 20,4) 12,1 (7,0; 16,8)
4 13 4
27
5
7/25 (28,0) 5/24 (20,8)
ND
3
19 95 24
121
58
Clinical Stage
n
Total
182 68/111 64,5 (46; 81)
***
p<0,000001
***
***
19,7 (0,4; 45,1)
1
2
3
Colon Rectal Positive/
cancer cancer total (%)
157
Positive/
total (%)
134
CEA {MRD positive/total (percentage of MRD positive)}
SB before
surgery
BM 1 month
after surgery
SB before
surgery
SB 1 month
after surgery
BM 1 month
after surgery
10/41 (24,39)
4/31 (12,90)
13/41 (31,71)
18/29 (62,07)
3/41 (7,32)
12/29 (41,38)
2
2/59 (3,39)
2/49 (4,08)
15/59 (25,42)
5/47 (10,64)
15/59 (25,42)
8/47 (17,02)
5/59 (8,48)
2/47 (4,26)
3
9/47 (19,15)
2/40 (5,00)
11/47 (23,47)
7/40 (17,50)
14/47 (29,79)
15/40 (37,50)
7/47 (14,89)
12/40 (30,00)
4
1/33 (3,03)
2/17 (11,77)
7/33 (21,21)
2/16 (12,50)
9/33 (27,27)
3/15 (20,00)
3/33 (9,09)
3/16 (18,75)
1
**
4/13 (30,77)
0/7 (0,00)
4/13 (30,77)
1/7 (14,29)
5/13 (38,46)
**5/8 (62,50)
1/13 (7,69)
*2/8 (25,00)
2
3/37 (8,11)
5/32 (15,63)
12/37 (32,43)
5/32 (15,63)
11/37 (29,72)
16/30 (53,33)
4/37 (10,81)
12/30 (40,00)
3
7/109 (3,67)
5/90 (5,56)
22/99 (20,95)
12/87 (13,79)
30/109 (27,52)
21/87 (24,13)
13/109 (11,93)
12/87 (13,79)
4
3/8 (37,50)
0/6 (0,00)
1/'8 (12,50)
0/6 (0,00)
3/8 (37,50)
3/5 (60)
0/8 (0,00)
2/6 (33,33)
0
*6/101 (5,94)
6/81 (7,41)
24/101 (23,76)
9/79 (11,39)
28/101 (27,72)
26/77 (33,77)
9/101 (8,91)
13/77 (16,88)
1
10/66 (15,15)
4/54 (7,41)
16/66 (24,24)
9/53 (16,98)
20/66 (30,30)
18/52 (34,62)
9/66 (13,63)
15/53 (28,30)
<5cm 3
2/18 (11,11)
2/16 (12,50)
2/18 (11,11)
0/15 (0,00)
3/18 (16,67)
7/14 (50,00)
1/18 (5,55)
6/14 (42,86)
5-100cm 3
10/99 (10,10)
6/81 (7,41)
24/99 (24,24)
14/77 (17,72)
33/99 (33,33)
25/79 (31,65)
13/99 (13,13)
14/79 (17,72)
>100cm3
0/12 (0,00)
0/10 (0,00)
5/13 (41,67)
1/10 (10,00)
1/12 (8,33)
1/9 (11,11)
1/12 (8,33)
1/9 (11,11)
Positive
140 (2,50)
0/33 (0,00)
6/40 (15,00)
4/32 (12,50)
7/40 (17,50)
8/31 (25,81)
2/40 (5,00)
9/32 (28,13)
Negative
14/110 (12,73)
6/96 (6,98)
30/110 (27,27)
9/84 (10,71)
34/110 (30,91)
27/83 (32,53)
13/110 (11,82)
15/83 (18,07)
Positive
2/33 (6,07)
1/28 (3,57)
6/33 (18,18)
4/27 (14,82)
8/33 (24,24)
9/26 (34,62)
2/32 (6,06)
7/27 (25,93)
Negative
11/104 (10,58)
5/84 (5,95)
28/104 (26,92)
9/82 (10,98)
31/104 (29,81)
25/81 (30,86)
13/104 (12,50)
15/81 (18,52)
Clinical stage
4/31 (12,90)
Patients of all clinical stages 1-4
*
**
p<0,05
p<0,01
**
BM before
surgery
*5/41 (12,20)
N
Volume
BM before
surgery
1
T
S_CA 19- S_CEA
SB 1 month
after surgery
CK 20 {MRD positive/total (percentage of MRD positive)}
**
Výsledky
• výsledky jsou prezentovány ve formě
Disease free survival (DFS) analýzy u
pacientů 1. – 3. klinického stádia
onemocnění
• pro stanovení celkového přežití (OS) je
medián doby sledování pro diagnózu
kolorektálního karcinomu zatím příliš
krátký
Disease free survival (DFS)
dle pozitivity CEA a CK20 mRNA
v periferní krvi
Disease free survival (DFS)
dle pozitivity CEA a CK20 mRNA
v kostní dřeni
Disease free survival (DFS)
dle dynamiky CEA a CK 20
v krvi a kostní dřeni
Závěry
MRD u kolorektálního karcinomu
1. Přítomnost MRD je nezávislým negativním
prognostickým znakem – kratší DFS
2. Význam II. odběru po odstranění
primárního tumoru – clearence nádorových
buněk, imunitní systém
3. Stanovení dynamiky exprese vybraných
markerů – nádorová heterogenita,
interindividuální variabilita
Prognostický význam mikrometastatického
postižení sentinelových lymfatických uzlin
u pacientek s karcinomem prsu
– výsledky tříletého sledování
Cíle studie
• Srovnání histopatologického vs. molekulárně
biologického (QRT-PCR) vyšetření
mikrometastáz v sentinelových lymfatických
uzlinách u pacientek s karcinomem prsu.
• Analýza parametrů přežití a zhodnocení
prognostického hodnoty mikrometastáz.
• pT1-2N0M0 – 1/3 pacientek se vrací s recidivou
– identifikace pacientek – ultrastaging.
Charakteristika souboru
celkem 44, medián věku 57 (28 – 80 let)
25% lobulární karcinom
75% duktální karcinom
Grading: G1
12%
G2
41%
G3
47%
Neoadjuvance:
2%
Stadium:
0
5%
I
40%
IIA
20%
IIB
18%
IIIA
10%
IIIB
2%
IV
5%
Chirurgický výkon: ve 100%
39% kvadrantektomie, exenterace
61% ablace, exenterace
Pacientek:
Histologie:
Sentinelové uzliny
Detekce pomocí radiofarmaka a gama kamery
peroperačně. Následná exenterace axilly.
½ sentinelové uzliny a axillární uzliny vyšetřeny
standardně histopatologicky (prokrájení, IHC
barvení)
½ sentinelové uzliny vyšetřena metodou QRTPCR
Recidiva po ablaci z jiného
pracoviště
DĚKUJI ZA POZORNOST
Vyšetření přítomnosti mikrometastáz
v sentinelových uzlinách
Soubor 44 pacientek (staging 0-IV)
Histopatologicky pozitivní
13/41 (32%)
QRT-PCR pozitivní
x
26/44 (59%)
dvě ze třinácti navíc pozitivně
vyšetřených pacientek byly pozitivní v
axillární oblasti
Histopatologicky pozitivní uzliny byly současně
pozitivní i molekulárně.
Pozitivní molekulární záchyt u histopatologicky
negativních uzlin je 36 %
Histopatologické vs. QRT-PCR vyšetření
mikrometastáz v sentinelových uzlinách
- mamaglobin MBG1
QRT-PCR pozitivní:
>10 kopií
MGB1/ugRNA
Histopatologicky
pozitivní:
>100 kopií
MGB1/ugRNA
Histopatologické vs. QRT-PCR vyšetření
mikrometastáz v sentinelových uzlinách
- karcinoembryonální antigen CEA
QRT-PCR pozitivní:
>250 kopií
CEA/ugRNA
Histopatologicky
pozitivní:
>25 000 kopií
CEA/ugRNA
Disease free survival (DFS) dle
histopatologického nálezu
v sentinelové uzlině
SU od 41 pacientek
28 histopatol. neg.
1x recidiva v jizvě
2x generalizace
1x LU
1x úmrtí
13 histopatol. poz.
2x generalizace
1x skelet
2x úmrtí
Disease free survival (DFS)
dle QRT-PCR nálezu v sentinelové uzlině
SU od 44 pacientek
18 QRT-PCR neg.
1x recidiva v jizvě
26 QRT-PCR poz.
4x generalizace
1x skelet
1x LU
3x úmrtí
Disease free survival (DFS) dle QRT-PCR
nálezu u pacientek s histopatologicky
negativními sentinelovými uzlinami
SU od 28 pacientek
(pT1-2N0M0)
18 QRT-PCR neg.
1x recidiva v jizvě (RT)
10 QRT-PCR poz.
2x generalizace
1x LU
1x úmrtí
Žádná z těchto 4
pacientek neobdržela
adjuvantní CHT.
Závěry
MRD u karcinomu prsu
1.
Vyšší záchyt mikrometastáz SU metodou real time RTPCR
histopatologicky 32% (13 pacientů)
versus
molekulárně 59% (26 pacientů)
2. Pozitivní molekulární záchyt u histopatologicky
negativních uzlin je 36 %, všechny histopatologicky
pozitivní uzliny byly zároveň molekulárně pozitivní
3. Mamaglobin MGB1 - vysoce specifický a senzitivní
marker
4. Predikce histopatologického postižení
5. QRT-PCR vyšetření dokáže identifikovat rizikové
pacientky ve skupině pacientek pT1-2N0M0 s potřebou
adjuvantní terapie.
Závěry
MRD u solidních nádorů
1.
Detekce MRD u solidních nádorů metodou QRT-PCR je
proveditelná, dostatečně senzitivní a specifická.
2.
Přítomnost MRD u pacientů s I-III. klinickým stádiem
kolorektálního karcinomu je nezávislým negativním
prognostickým znakem.
3.
Přítomnost MRD identifikuje rizikové pacientky ve
skupině pacientek s karcinomem prsu pT1-2N0M0 s
potřebou adjuvantní terapie.
Poděkování
1.
Kolegům z Laboratoře experimentální medicíny
2.
Kolegům z klinických pracovišť FN Olomouc
3.
Práce na tomto projektu byla podporována granty
MSM6198959216, IGA MZCR NR/7804-5 a MPO
1H-PK/45.
Děkuji za pozornost
Otázky a odpovědi
•
1. Proč jsou autorem publikovány dvě rozdílné cutoff hodnoty pro přítomost MRD v kostní dřeni (250
vs. 350 kopií CEA/цg RNA?
•
Jedná se o dva rozdílné soubory pacientů. RNA byla
izolována dvěma rozdílnými metodami, což má vliv i
na míru exprese sledovaných markerů MRD. Cut-off
hodnota byla původně stanovena arbitrárně, následně
byla upravena – zvýšena na základě statistických
analýz přežití.
Otázky a odpovědi
•
2. Jakým způsobem je v současnosti na příslušném
pracovišti řešeno paralelní
histologické/imunohistochemické a molekulárně
genetické vyšetření sentinelové uzliny u pacientek s
karcinomem prsu?
•
Jedná se vyšetření ½ sentinelové uzliny
histopatologicky a ½ uzliny molekulárně-geneticky
následované axillární disekcí v rámci zaškolení
chirurgického týmu.
Otázky a odpovědi
•
3. Jaký byl důvod zařazení pacientky po
neoadjuvantní léčbě do souboru pacientek s
karcinomem prsu pro vyšetření MRD v
sentinelových uzlinách?
•
Do klíčové DFS analýzy pT1-2N0M0 pacientek nebyla
zařazena.
Otázky a odpovědi
•
4. Jak si vysvětlujeme diskrepanci v procentuálním
zastoupení přítomnosti MRD v kostní dřeni a
systémové krvi u pacientů I. klinického stádia
kolorektálního karcinomu?
•
Jednak se může jednat o vliv malých čísel, dále o nižší
citlivost a specificitu CK20, o vyšší expresi
nádorových markerů u menších tumorů a o vliv
imunitních mechanismů u nižších klinických stádií.
Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly
mezi klinickými stádii (p<0,05). Kombinace markerů.
CEA {MRD positive/total (percentage of MRD positive)}
SB before
surgery
BM 1 month
after surgery
SB before
surgery
SB 1 month
after surgery
BM 1 month
after surgery
10/41 (24,39)
4/31 (12,90)
13/41 (31,71)
18/29 (62,07)
3/41 (7,32)
12/29 (41,38)
2
2/59 (3,39)
2/49 (4,08)
15/59 (25,42)
5/47 (10,64)
15/59 (25,42)
8/47 (17,02)
5/59 (8,48)
2/47 (4,26)
3
9/47 (19,15)
2/40 (5,00)
11/47 (23,47)
7/40 (17,50)
14/47 (29,79)
15/40 (37,50)
7/47 (14,89)
12/40 (30,00)
4
1/33 (3,03)
2/17 (11,77)
7/33 (21,21)
2/16 (12,50)
9/33 (27,27)
3/15 (20,00)
3/33 (9,09)
3/16 (18,75)
1
**
4/13 (30,77)
0/7 (0,00)
4/13 (30,77)
1/7 (14,29)
5/13 (38,46)
**5/8 (62,50)
1/13 (7,69)
*2/8 (25,00)
2
3/37 (8,11)
5/32 (15,63)
12/37 (32,43)
5/32 (15,63)
11/37 (29,72)
16/30 (53,33)
4/37 (10,81)
12/30 (40,00)
3
7/109 (3,67)
5/90 (5,56)
22/99 (20,95)
12/87 (13,79)
30/109 (27,52)
21/87 (24,13)
13/109 (11,93)
12/87 (13,79)
4
3/8 (37,50)
0/6 (0,00)
1/'8 (12,50)
0/6 (0,00)
3/8 (37,50)
3/5 (60)
0/8 (0,00)
2/6 (33,33)
0
*6/101 (5,94)
6/81 (7,41)
24/101 (23,76)
9/79 (11,39)
28/101 (27,72)
26/77 (33,77)
9/101 (8,91)
13/77 (16,88)
1
10/66 (15,15)
4/54 (7,41)
16/66 (24,24)
9/53 (16,98)
20/66 (30,30)
18/52 (34,62)
9/66 (13,63)
15/53 (28,30)
<5cm 3
2/18 (11,11)
2/16 (12,50)
2/18 (11,11)
0/15 (0,00)
3/18 (16,67)
7/14 (50,00)
1/18 (5,55)
6/14 (42,86)
5-100cm 3
10/99 (10,10)
6/81 (7,41)
24/99 (24,24)
14/77 (17,72)
33/99 (33,33)
25/79 (31,65)
13/99 (13,13)
14/79 (17,72)
>100cm3
0/12 (0,00)
0/10 (0,00)
5/13 (41,67)
1/10 (10,00)
1/12 (8,33)
1/9 (11,11)
1/12 (8,33)
1/9 (11,11)
Positive
140 (2,50)
0/33 (0,00)
6/40 (15,00)
4/32 (12,50)
7/40 (17,50)
8/31 (25,81)
2/40 (5,00)
9/32 (28,13)
Negative
14/110 (12,73)
6/96 (6,98)
30/110 (27,27)
9/84 (10,71)
34/110 (30,91)
27/83 (32,53)
13/110 (11,82)
15/83 (18,07)
Positive
2/33 (6,07)
1/28 (3,57)
6/33 (18,18)
4/27 (14,82)
8/33 (24,24)
9/26 (34,62)
2/32 (6,06)
7/27 (25,93)
Negative
11/104 (10,58)
5/84 (5,95)
28/104 (26,92)
9/82 (10,98)
31/104 (29,81)
25/81 (30,86)
13/104 (12,50)
15/81 (18,52)
Clinical stage
4/31 (12,90)
Patients of all clinical stages 1-4
*
**
p<0,05
p<0,01
**
BM before
surgery
*5/41 (12,20)
N
Volume
BM before
surgery
1
T
S_CA 19- S_CEA
SB 1 month
after surgery
CK 20 {MRD positive/total (percentage of MRD positive)}
**
Otázky a odpovědi oponentů
•
Exprese CEA v tumoru v závislosti na klinickém
stádiu, na velikosti primárního tumoru a stupni
invazivity.
Otázky a odpovědi oponentů
•
5. Jaký má doktorand názor na rozpor mezi nízkým
proliferačním potenciálem okultních nádorových
buněk a použitím standardní chemoterapie určené
k jejich eliminaci?
•
Proces metastazování - 1 z 10 tis. CTC metastazuje
Clearence CTC.
Efekt standardní chemoterapie - cca 10% v přežití.
Dormant cells – až 19 let pro primárním tumoru meta.
Biologická léčba – imunofenotypizace CTC
Otázky a odpovědi oponentů
•
•
•
DohbaS., Kondoh M., Fujita H., et al: A case of 19th year
pulmonary metastasis after radical mastectomy for breast
cancer. Kyobu Geka. 2000 Dec;53(13):1129-32.
Liotta L. A., Stetler – Stevenson W. G.: Tumor invasion
and metastasis: an imbalance of positive and negative
regulation. Cancer Res, 1991, 51(18), 5054-59.
Circulating tumor cells in HER-2 positive metastatic breast
cancer patients treated with trastuzumab and chemotherapy.
Nunes RA, Li X, Kang SP, et al.: Int J Biol Markers. 2009
Jan-Mar;24(1):1-10.
Otázky a odpovědi oponentů
•
6. Jaký interval a jaký kompartment považuje
doktorand za optimální k vyšetřování MRD a její
dynamiky?
•
Dle publikovaných prací a našich výsledků se nám v
současnosti jeví vhodné vyšetřovat více než jeden
kompartment, např. systémovou krev a kostní dřeň.
Interval je různý, ale optimální z prognostického
hlediska bude cca od 1 týdne po odstranění primárního
tumoru.
•
Otázky a odpovědi oponentů
•
7. V jaké perspektivě vidí autor reálné využití
detekce MRD k tailorování terapie pacientů
karcinomem kolorekta?
•
Dle zkušeností s hematologickými malignitami, kde
implementace MRD konceptu do algoritmu léčby
trvala cca 5 let od publikování výsledků velkých studií,
to bude vzhledem k současnému nedostatku velkých
studií u solidních tumorů trvat cca 5-10 let.
•
Otázky a odpovědi oponentů
•
8. Jaká je využitelnost monitorování MRD u
nemalobuněčné plicní rakoviny?
•
Obdobná jako u karcinomu prsu a kolorekta, v
identifikaci rizikových pacientů nízkých klinických
stádií s možností cílené biologické léčby.