8. Měření kinetiky dohasínání fluorescence v časové doméně

8. Měření kinetiky dohasínání
fluorescence v časové doméně
Kinetika dohasínání fluorescence
F
N
Prointegrováním a uvážením, že měřená
intenzita je úměrná počtu částic, dostaneme
I(t) = I0 e – t / τ
kde doba života τ = (kF + kN)-1
Střední doba života je rovna (pro
jednoexponenciální dohasínání)
∫ tI (t )dt ∫ t. exp(− t τ )dt
∞
t =
0
∞
∫ I (t )dt
0
7500*exp(-t/5.5)+2500*exp(-t/8)
2500*exp(-t/4.5)+7500*exp(-t/6.7)
8000
6000
4000
2000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
čas (ns)
∞
=
0
∞
( τ)
∫ exp − t dt
0
τ2
=
=τ
τ
Střední doba života není závislá na
koncentraci, proto bývají informace o
mikrookolí fluoroforu spolehlivější než
pouhé měření intenzity.
Problémem je analýza složitějších systémů
I (t ) = I 0 ∑ α i exp − t 
τi 

i
10000
7500*exp(-t/5.5)+2500*exp(-t/8)
2500*exp(-t/4.5)+7500*exp(-t/6.7)
1000
počet fotonů
dt
10000
počet fotonů
Po excitaci vzorku δ-pulsem se hladina S1
depopuluje podle
dn(t )
= −(k + k )n(t )
100
10
1
0
5
10
15
20
25
30
čas (ns)
35
40
45
50
Střední doba života
Více-exponenciální kinetika dohasínání fluorescence
D = ∑α i e
−
t
τi
Střední doba života - vážená amplitudami
τm
∑α τ
=
∑α
i i
i
i
i
Střední doba života - vážená
steady-state intenzitou
τm
∑ fτ
=
∑f
i i
i
i
i
∑α τ
=
∑α τ
2
i i
i
i i
i
Příklad 8.1: Spočítejte střední dobu
života váženou (a) amplitudami, (b)
intenzitami pro znázorněný příklad.
Hradlovaná detekce (gated detection)
Pulsní (časová) doména – excitace δ-pulsem
n * (t ) = n * (0)e
I (t ) = I (0)e
−
−
t
τ
t
τ
Hradlovaná (gated) detekce
intenzita
exc. pulz
fluorescence
otevření
hradla
čas
Historicky nejstarší metoda pro měření kinetiky
dohasínání fluorescence v časové doméně
Hradlování může být zajištěno buď tím, že je
detektor zapnut jen na velmi krátkou dobu, nebo
tím, že detektor je zapnut po celou dobou
měření, ale elektrický signál je snímán
stroboskopicky.
Intenzita je proměřena pro časové intervaly s
různě dlouhou prodlevou po excitačním pulzu
Díky horšímu rozlišení (IRF~3 ns) a
systematickým artefaktům prakticky opuštěna,
nyní se v některých aplikacích začíná vracet
Výhody:
- relativně levná
- možnost rychlého načtení celé dohasínací
křivky
- s výhodou využívána např. v mikroskopii nebo
pro měření pomalejších kinetik
Metoda časově-korelovaného čítání fotonů
(time-correlated single-photon counting, TCSPC)
Intenzita ~ Pravděpodobnost emise
Vzorek ozařujeme sérií pulzů
Po každém pulzu detekujeme nejvýše jeden
emitovaný foton, pro nějž přesně změříme
čas, ve kterém přiletěl na detektor
Údaje o časech příletu shromažďujeme v
histogramu
Pro velký počet zaznamenaných fotonů
histogram rekonstruuje dohasínací křivku
Výhody:
- vysoké rozlišení (běžné přístroje τ > 50 ps)
- analýza více-exponenciálního dohasínání
- malá náchylnost k systematickým artefaktům
- směrodatná odchylka počtu detekovaných
fotonů v každém kanálu (Ni) je dána
Poissonovskou statistikou (Ni)1/2
- možnost porovnání fitovaného modelu s
teoretickou předpovědí
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
U
Princip měření TCSPC
START
reverzní mód TAC
STOP
t
Rychlost měření
chceme načíst co nejvíce fotonů (alespoň 5.106)
opakovací frekvence je limitována
hardwarově
kinetikou dohasínání
t
účinnost detekce - čím větší, tím lepší ...
... ale jen do určité míry
„pile-up“ efekt
EXC
Statistika musí být úplná !
OK
OK
NE
DET
0
t
0
t
I
Eliminace „pile-up“ efektu:
„Count-rate“ musí být < 1%.
Tzn. při opakovací frekvenci 10 MHz
můžeme detekovat max. 105 fotonů
za 1s.
Příklad 8.2: Za jak dlouho jsme schopni za
optimálních podmínek nasbírat histogram
z 5.106 fotonů ?
Přesnost měření
log I
t
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
tvar excitačního pulsu
nestabilita elektroniky (time-jitter)
časový interval pro 1 kanál při ukládání dat
transit-time spread
počet detekovaných fotonů
stabilita vzorku
Analýza dat
Funkce přístrojové odezvy není δ-funkce
M = IRF ⊗ D
Časový posun (shift) mezi detekcí IRF a M
Dohasínání nemusí být monoexponenciální
D = ∑α i e
D=
−
∞
t
τi
∫ α (τ ).e
τ =0
β
 t
− 
 τ
D=e
D=e
t
− −2b t
τ
−
více komponent
t
τ
distribuce
„natažená“ exponenciála
přechodové jevy
Je velmi užitečné, mít představu o tom, jak má vypadat dohasínání
Metody vyhodnocování
Metoda nejmenších čtverců (LSA)
zadáme model dohasínání
zadáme parametry, které chceme najít
hledáme minimum funkce
N
χ =∑
2
i =1
(X
EXP
i
− X iFIT
σ i2
)
2
N
=∑
i =1
(X
− X iFIT
X iEXP
EXP
i
)
2
Použitelnost LSA
1. Neurčitost v experimentálních datech
se týká pouze závislé proměnné (y-osa)
2. Neurčitosti v závislé proměnné mají
Gaussovskou distribuci
3. Závislá (y) ani nezávislá (x) proměnná
není zatížena systematickou chybou
4. Funkce použitá pro fitování je
správným matematickým popisem
systému. Nesprávné modely dávají
nesmyslné parametry.
5. Všechny body v souboru jsou
navzájem nezávislé.
6. Máme dostatečné množství dat, takže
hledané parametry jsou přeurčené.
Tyto podmínky bývají
v TCSPC splněné
Metody vyhodnocování
Metoda maximální entropie (MEM)
vybereme interval, ve kterém očekáváme,
že se doby života budou nacházet
rozdělíme tento interval na n částí
fitujeme podle modelu
−
n
t
∑ α .e τ
i =1
i
i
přičemž τi jsou dána rozdělením intervalu
a hledáme pouze αi, přičemž hledáme
maximum funkce

 X fit (t )  

∫0 dt  X fit (t ) − X exp (t ) − X fit (t )log X exp (t )  



∞
Výhodné při analýze složitých systémů
Nepředpokládáme a priori počet komponent ani jejich distribuce
Kvalita
fitu
nejdůležitějšími kritérii jsou:
χR2
náhodnost rozložení residuí
(
1 N X iEXP − X iFIT
2
χR =
∑
N − p i =1
σ i2
)
2
(
1 N X iEXP − X iFIT
=
∑
N − p i =1
X iEXP
)
2
Autokorelační funkce
udává, nakolik koreluje odchylka v k-tém bodě s odchylkou v (k+j)-tém bodě
1 m
∑ Dk Dk + j
m k =1
C (t j ) =
1 n 2
Dk
∑
n k =1
Dk ... odchylka v k-tém bodě
n ... celkový počet kanálů
m ... počet kanálů přes který se počítá autokorelace
Provázanost parametrů
Detektory
Fotonásobiče (PMT) - levné, transit-time-spread > 100 ps, after-puls
Mikrokanálové destičky (MCP PMT)
transit-time-spread ~ 30 ps
menší intenzita afterpulsů
dražší
Lakowicz – Principles of Fluorescence
Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999
Fotodiody (PD)
velmi levné, ale nemají potřebné zesílení
Lavinové fotodiody (APD)
rostoucí popularita, pro některé aplikace nejpoužívanější detektor
problémem velmi malá aktivní plocha (typicky 10 µm x 10 µm)
FWHM pulsu od 20 ps
Rozmítací kamera (streak camera)
současně zaznamenaná informace o časových charakteristikách a o vlnové délce
výhodné pro současné zaznamenání celého spektra
Upconversion
Umožňuje detekci velmi krátkých časů < 2 ns
Rozlišení je dáno šířkou laserového pulsu (> 10 fs)
excitace
vzorek
zpožďovací linka
detektor
„cut-on“ filtr
„cut-off“ filtr
emise
hradlovací pulz
generace druhé harmonické frekvence
pulzní Ti:Sapph
laser, 800 nm
sčítání frekvencí
I (t,λ) = I0 Σ αi(λ) exp (-t/τi)
Globální analýza
Možnost rozlišení komponent,
jejichž emisní spektra se
překrývají, ale lifetimy jsou různé.
Lakowicz – Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999
DAS (decay-associated spectra)
TRES (time-resolved emission spectra)
S2
kR
S1
absorpce
S0
kA
hνA
kN
relaxace
v3
v2
v1
v0
kE
emise
hνE
v3
v2
v1
v0
Energie
v2
v1
v0
TTTR (time-tagged-time-resolved)
Je zaznamenáno zpoždění emitovaného fotonu vůči excitačnímu pulzu, ale
také doba příletu v absolutní časové škále
To umožňuje sledovat kompletní časový vývoj systému - intenzity i kinetiky
dohasínání
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
FluoTime 200 (PicoQuant)
Zdroje: pulsní LED 298 nm (10 MHz, 1,8 µW)
pulsní LED 308 nm (10 MHz, 0,9 µW)
pulsní laserová LED 445 nm (40 MHz, 1,8 mW)
Excitační a emisní polarizátor
Motorizovaný monochromátor (λblaze=450 nm)
Fotonásobič PMA-182-P-M (185-820 nm)
PicoHarp 300 (rozlišení 4 ps)
Software: FluoFit Pro 4.2.1 (LSA)
Flame5 (MEM)
SHRNUTÍ
Měření doby života excitovaného stavu v časové doméně
Excitace pulzním zdrojem světla (ideálně δ-pulz)
Způsob záznamu kinetiky dohasínání - hradlovaná detekce, korelované čítání
jednotlivých fotonů (TCSPC), záznam TTTR (time-tagged-time-resolved)
Analýza dat - dekonvoluce přístrojové funkce, použití správného modelu, problémy
při analýze složitějších systému, metoda nejmenších čtverců (LSA), metoda
maximální entropie
Identifikace správného fitu - χR2, rozložení reziduí, autokorelační funkce
Detektory - fotonásobiče, MCP, fotodiody, lavinové fotodiody, rozmítací kamery,
metoda „up-conversion“
Metody se spektrálním rozlišením - TRES, DAS