16. bioremediační technologie k odstranění polychlorovaných

R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16. BIOREMEDIAČNÍ TECHNOLOGIE K ODSTRANĚNÍ
POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ ZE ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ
16.1 Bioremediační technologie
16.1.1 Úvod
Během posledních let jsme svědky enormního rozvoje kontrolovaného, praktického využití
biologických systémů pro rozkládání chemických polutantů v životním prostředí. Tyto různé
technologie jsou závislé na biodegradační aktivitě mikroorganismů a rostlin a jsou zaměřeny na
zvýšení již existujícího biodegradačního procesu přímo v přírodě nebo v různých typech reaktorů, kde
je umožněn přímý kontakt chemikálie s degradujícími organismy.
Oproti chemickým a fyzikálním metodám využitelným pro odstraňování nežádoucích polutantů mají
biologické procesy řadu výhod, z nichž lze jmenovat velkou flexibilitu biologických systémů,
jednoduchost aplikace a v neposlední řadě nízkou cenu. Za nevýhodu se považuje omezené využití pro
odstraňování anorganických sloučenin, delší doba procesu a nutnost detailní charakterizace znečištěné
lokality.
V dalších kapitolách budou podrobněji probrány jednotlivé bioremediační technologie a podmínky
jejich využití.
16.1.2 Obecná charakteristika bioremediace
Cílem bioremediace je degradace organických polutantů tak, aby jejich koncentrace byla buď pod
hranicí detekčního limitu nebo taková, že by nepřevyšovala koncentrační limit daný příslušnou
vyhláškou. Bioremediace lze využít pro čištění půdy, spodních vod, odpadních vod, kalů a plynů.
V současné době je počet sloučenin, které mohou podléhat biologické destrukci, značný. Vzhledem
k závažnosti účinků některých polutantů na zdraví nebo ekologické riziko se bioremediační
technologie v současnosti soustřeďují zejména na degradaci ropy a ropných produktů, polycyklických
aromatických uhlovodíků, chlorovaných aromatických a alifatických uhlovodíků a v poslední době se
ukazuje i perspektivnost využití těchto technologií pro POPs, konkrétně polychlorované uhlovodíky.
Praktické využití biodegračních procesů je však limitováno řadou faktorů, které vlastní proces
bioremediace v konkrétním prostředí ovlivňují.
Faktory, které ovlivňují úspěšnost použité bioremediační technologie jsou následující:
•
•
•
•
•
•
přítomnost organismů (mikroorganismů, rostlin), které jsou schopné efektivně degradovat
polutant
schopnost těchto organismů transformovat organický polutant akceptovatelnou rychlostí na
výslednou koncentraci polutantu povolenou zákonem
při degradaci vznik látek (meziproduktů), které by v dosažené koncentraci byly toxické
na zkontaminované lokalitě přítomnost dalších chemických látek nebo jejich směsí, které
by potlačovaly růst a metabolickou aktivitu degradační mikroflory
dostupnost polutantů mikroorganismům
na lokalitě zajištění nezbytných podmínek stimulujících růst a degradační metabolismus
použitých organismů např. anorganické živiny, kyslík nebo vhodné akceptory elektronů,
stopové prvky, vlhkost prostředí, odpovídající teplota, pH, zdroj uhlíku a energie pro růst,
induktor katabolické dráhy
VII-75
R-T&A
•
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
cena technologie musí být nižší nebo při nejhorším stejná jaké cena jiné technologie
schopné destruovat cílový polutant.
K výše uvedeným faktorům dále přistupují např. možnosti přípravy adaptovaných bakterií se zvýšenou
degradační schopností nebo, v posledně době tolik diskutované, využití geneticky modifikovaných
bakterií a rostlin
Pro dosažení uspokojivých výsledků sanace jsou všechny uvedené faktory stejně významné a
nemohou být opomíjeny.
16.1.3 Rozdělení bioremediačních technologií
Bioremediační technologie lze rozdělit dle místa jejich aplikace na:
•
•
in situ, které jsou aplikovány přímo na zkontaminované lokalitě; jsou relativně levné, ale
jejich průběh je obtížně kontrolovatelný
ex situ, ve kterých je kontaminovaný materiál odstraněn z původní lokality a buď
k degradaci dochází na místě odstranění (on site) nebo je odstraněná kontaminovaná
matrice převezena na jiné místo kde probíhá vlastní biodegradační proces na
dekontaminační ploše nebo v bioreaktoru (off site). Přemisťování kontaminované zeminy či
spodní vody sice značně zvyšuje celkové náklady, ale proces je velmi dobře
kontrolovatelný.
Mezi in situ technologie patří bioventing, podpořená bioremediace (enhancing bioremediation),
přirozená atenuace (natural attenuation) a fytoremediace.
Ex situ technologie zahrnují bioremediace v suspenzním systému (slurry phase bioremediation),
bioremediace v pevné fázi (solid phase bioremediation), do které patří technologie jako jsou land
farming a kompostování a jejich modifikace.
16.1.3.1 In situ metody
16.1.3.1.1 Bioventing
Metodu lze využít pro pro kontaminanty, které jsou degradovatelné za aerobních podmínek a mají tlak
par nižší než 1 atm. Lehce těkající organické látky se spíše odpaří než by byly zdegradovány. Tuto
metodu lze aplikovat v prostupné nenasycené půdní zoně, tj. nad vrstvou vody a je založena na
zavádění vzduchu do půdy buď metodou přímé injektáže nebo cirkulací přes vakuový extrakční
systém (obrázek 16-1). Vháněný vzduch usnadňuje těkání některých organických kontaminantů a
souběžně zajišťuje vhodné prostředí pro biodegradaci méně těkavých látek.Teplota a pH půdy může
významně ovlivnit průběh celého procesu. V současné době byla popsána celá řada variant tohoto
procesu, ale základní požadavek tj. zajištění optimálního přísunu vzduchu, a tím i kyslíku, pro
degradační procesy aerobní mikroflory přítomné v kontaminované půdě, je ve všech stejná. Přísun
vzduchu do nenasycené zony může být prováděn buď přes horizontální nebo vertikální vrty a
v některých případech může být bioventing kombinován s extrakcí par z půd, což umožňuje zlepšit
kontrolu toku zaváděného vzduchu.
VII-76
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Metodu lze s výhodou použít pro BTEX, fenol a dále pro TCE, chloroform, DCE, vinylchlorid,
chlorbenzen. Není vhodná pro odstraňování tetrachlorethylenu a polychlorovaných bifenylů (PCBs).
16.1.3.1.2 Zlepšená bioremediace (Enhanced bioremediation, Biostimulace)
Při této technologii se využívá přímý přídavek živin do půdy, který tím že podporuje růst přítomné
přirozené mikroflory, zvyšuje i biodegradaci organických polutantů. Tento postup má řadu nevýhod.
Je značně pomalý, velmi těžko se zajišťuje rovnoměrná aplikace živin a kontrola biodegradačního
procesu. Současně může docházet i k odplavování organických látek event. těžkých kovů do spodních
vod nebo dochází k emisím snáze těkajících organických látek. V těchto případech musí být zajištěna
spolehlivá kontrola obou možných procesů. Hlavní výhodou této metody jsou velmi nízké náklady na
vybavení a průběh technologie.
Obrázek 16-1: Základní schéma bioventingové technologie
Další variantou této metody je land farming (viz dále), kdy se stejným způsobem ošetřuje odtěžená
půda, což umožňuje lepší kontrolu celého procesu. Obě uvedené metody se s výhodou používají pro
odstraňování kontaminace ropou a ropnými uhlovodíky. Pro biodegradaci PCBs není tato metoda
vhodná.
16.1.3.1.3 Přirozená atenuace
Přirozená atenuace je založená na přirozených metabolických procesech, které probíhají v
mikrobiálních a rostlinných buňkách. V průběhu těchto procesů se odstraňují organické polutanty
z kontaminovaných míst. Přirozená atenuace byla demonstrována na několika případech čištění
spodních vod. Pro její stanovení jsou vyžadovány tři typy informací:
VII-77
R-T&A
•
•
•
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
data z dlouhodobého monitorování cílové lokality, která jasně ukazují, že koncentrace
kontaminantu v průběhu sledování klesá; sledování koncentrace musí probíhat dlouhou
dobu a sledovaná lokalita musí být podrobně charakterizována
koncepční a prediktivní model k dosažení přirozené atenuace
stanovení rizika pro ekosystém a pro lidskou populaci
Pokles koncentrace cílového polutantu během sledované doby může mít řadu důvodů, z nichž jenom
jeden je kompletní mineralizace. Důvody jsou odpařování, adorpce na částice půdy, biotransformace,
chemická a fotochemická oxidace.
Přirozenou atenuaci lze využít pouze pro biodegradovatelné organické látky. Bylo navrženo několik
prediktivních modelů, které by mohly umožnit předpovědět biodegradabilitu různých organických
látek, ale žádný z nich nám dosud neumožňuje spolehlivou předpověď zda bude sledovaný polutant
mineralizován a jaké intermediáty metabolismu se budou v průběhu procesu hromadit. Tyto modely
jsou založeny na fyzikálních a termodynamických vlastnostech polutantů event. na bioakumulaci a
rychlosti biodegradace polutantů za laboratorních podmínek. Koncepční modely jsou spíše založeny
na konkrétních znalostech biochemických procesů podílejících se na biodegradaci než na degradační
kinetice a přenosu hmoty polutantu.
Přirozenou atenuaci ovlivňuje řada faktorů jako je původ polutantu jeho biodegradabilita, rozpustnost,
koncentrace a toxicita. Dále pak celková charakteristika kontaminovaného místa tj. vlastnosti půdy,
velikost částic, pH, teplota, přítomnost těžkých kovů a jiných toxických látek. V neposlední řadě
potom i vlastnosti přítomné mikrobiální populace, přítomnost příslušných katabolických genů.
Do dnešní doby byla přirozená atenuace využita převážně pro halogenovaná rozpouštědla a ropné
uhlovodíky. Mezi další polutanty, které mají předpoklady pro přirozenou atenuaci patří chlorbenzeny,
chlorfenoly, chlorbenzoáty a PCBs. PCBs jsou dehalogenovány kometabolicky za methanogenních
podmínek. Bylo popsáno již několik případů tohoto procesu. Mineralizace takto vzniklých
nízkochlorovaných kongenerů je v zásadě možná. Jak ukazují i poslední výzkumy, do přeměny PCBs
jsou zahrnuty i rostliny jejichž produkty uvolňované do půdy mohou také stimulovat degradaci PCBs.
Výhoda přirozené atenuace spočívá v minimálních nákladech, ale celý proces je dlouhodobý a může
trvat i několik let a vyžaduje důsledný kontrolní systém.
16.1.3.1.4 Fytoremediace
Fytoremediace je definována jako užití zelených rostlin k přesunu, akumulaci a odstranění polutantů
z životního prostředí nebo zmírnění jejich škodlivého šíření. V mnoha studiích bylo prokázáno, že
rostliny jsou schopné akumulovat a přeměňovat anorganické i organické polutanty. Mezi anorganické
látky znečišťující životní prostředí patří především těžké kovy – mangan, zinek, kobalt, olovo,
kadmium a z organických látek jsou to ropné uhlovodíky, muniční odpady (TNT, DNT),
nitrosloučeniny nebo chlorovaná rozpouštědla (TCE, PCE), bojové chemické látky, polyaromatické
uhlovodíky, chlorované pesticidy, organofosfátové insekticidy (parathion) a
polychlorované
uhlovodíky.
Pro účinnou fytoremediaci je důležité, aby znečišťující látky byly snadno dostupné kořenovému
systému rostlin, který tyto látky dále transportuje do rostlinných tkání, kde jsou přeměňovány a
ukládány. Na celém procesu se podílejí také mikroorganismy, které žijí v symbióze s rostlinami,
zejména v oblasti rizosféry – kořenové části rostlin.
VII-78
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
Rostliny při dekontaminaci uplatňují několik mechanismů:
•
•
•
přímou absorpci kořeny, následný přesun do rostlinné tkáně a akumulaci ve formě
nefytotoxických metabolitů; některé rostliny absorbují organické látky přímo
z kontaminované půdy; nerozpustné látky se většinou váží pevně na povrch kořenů, látky
s vyšší rozpustností jsou transportovány přímo do rostlinných tkání, kde mohou být
různými detoxikačními mechanismy přeměňovány na nefytotoxické sloučeniny a dále pak
ukládány např. do vakuol nebo ve formě ligninu do buněčné stěny (obrázek 16-2).
uvolňování enzymů do prostředí, které podporují mikrobiální aktivitu a biochemickou
transformaci v půdě; ve vzorcích půd z kontaminovaných míst bylo identifikováno pět
enzymových systémů, které se pravděpodobně podílejí na transformaci organických látek
v životním prostředí. Patří mezi ně dehalogenasy, reduktasy organických sloučenin,
peroxidasy, lakasa (fenoloxidasa) a nitrilasy.
zvýšenou mineralizací látek v rhizosféře, která je typická pro činnost hub a mikrobiálních
konsorcií; v kořenovém systému rostlin je obvykle přítomno nejvíce bakterií (asi 106-108)
a dále asi 105 aktinomycet a 103 hub na gram půdy. Rostliny napomáhají mikrobiální
mineralizaci v rhizosféře tím, že uvolňují do půdy látky, které mohou sloužit
mikroorganismům jako zdroj uhlíku a energie pro kometabolismus organických látek
znečišťujících životní prostředí. Rostlinné exudáty obsahují hlavně enzymy, alifatické a
aromatické látky (fenoly, terpeny, flavonoidy), aminokyseliny a cukry. Některé z těchto
látek mohou působit též jako induktory bakteriálních drah degradace některých
organických xenobiotik (např. PCBs).
.
GSH
X
ATP
X-SG
1
ADP+P i
X
Vakuola
transformace
X
3
X
?
CP450
UDP-glukosa
X-OH
2
X-glc
ATP
ADP+P i
ER
První fáze
Druhá fáze
Třetí fáze
Obrázek 16-2: Mechanismus transformace organických polutantů v rostlinných buňkách
X…….organické xenobiotikum
ER……………endoplazmatické retikulum
GSH…glutathion
CP450………cytochrom P450
VII-79
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Rostliny používají pro transformaci polutantů, na rozdíl od mikroorganismů, zcela odlišné
mechanismy. Ty můžeme rozdělit dle způsobu uplatnění:
•
•
•
•
•
•
•
Fytoextrakce (fytoakumulace) založená na schopnosti rostlin přijímat a akumulovat škodlivé
látky ve svých kořenech i nadzemních částech.
Transformace (fytodegradace) je přímá degradace organických polutantů na méně toxické
nebo netoxické sloučeniny.
Rhizosférní degradace využívá činnosti rostlin a mikroorganismů.
Rhizofiltrace, při které dochází k adsorpci nebo absorpci polutantů, přítomných v nejbližším
okolí, do kořenů rostlin. Tento mechanismus je podobný fytoextrakci, ale používá se pro
odstranění polutantů ze spodních vod, spíše než z půdy. Pokusy mohou být prováděny in situ
nebo je voda přečerpána do speciálních nádrží vyplněných kořeny příslušných rostlin.
Předpěstovávané rostliny žijí ve vodných prostředích s nízkou hladinou kontaminace a až po
určité době jsou přesazeny přímo na kontaminované místo. Z mnoha testovaných rostlin se
jako jedny z nejúčinnějších ukázaly hydroponicky pěstované slunečnice, např. využívané
k odstranění radionuklidů z povrchové vody v okolí Černobylu.
Fytostabilizace napomáhá stabilizovat kontaminované místo, snaží se omezit rozšiřování
polutantů např. erozí nebo prosakování do spodní vody jejich pevnější vazbou na půdní
částice. Používá se při rekultivacích kontaminovaných ploch, kde přes poměrně nízké hladiny
koncentrací polutantů neroste přírodní vegetace.
Převedení do plynné fáze, kdy některé polutanty procházejí rostlinou do listů a vypařují se do
atmosféry ve stejné nebo částečně modifikované formě. Jak bylo prokázáno u topolů, 90 %
TCE (trichlorethylenu) odebraného z půdy bylo odpařeno.
Užití rostlin pro odstranění polutantů ze vzduchu, které využívá schopnosti některých rostlin
vázat polutanty přítomné v ovzduší na povrch listů např. schopnost vázat olovo zachycené
z benzínových zplodin
Fytoremediace může být aplikována při odstraňování anorganických i organických polutantů
přítomných v pevných částech (půda), kapalných částech (voda) a ve vzduchu. Je také známo, že
fytoremediace je nejlépe využitelná na velkých plochách, kde kontaminace dosahuje maximálně do 5
metrů hloubky.
Výhodou fytoremediace je její vysoká efektivita, produkce biomasy může dosáhnout až 100 tun na
hektar plochy za rok. Při růstu rostlin nedochází k poškozování životního prostředí, jelikož nejsou
potřeba těžké stroje ani převoz zeminy. Používání fytoremediace je též akceptováno veřejností.
Nevýhodou fytoremediace je negativní ovlivnění jejího průběhu a výsledné kontaminace různými
vlastnostmi půdy a životními podmínkami v místě znečištění. Struktura půdního profilu, pH,
koncentrace solí, polutantů a přítomnost dalších toxínů - tyto faktory mohou být limitující s ohledem
na toleranci použité rostliny. Kontaminanty se mohou hromadit v listech a mohou být znovu
uvolňovány (např. při opadávání listů) do prostředí. V některých případech se zvyšuje rozpustnost
polutantů a může dojít k jejich rozšíření do okolního prostoru
Fytoremediace je také pomalejší než běžné jiné biologické či fyzikální a chemické metody, a proto je
nutné uvážit i časové hledisko při výběru metody.
Některé limitující faktory fytoremediace by mohly být odstraněny s použitím geneticky
modifikovaných rostlin. Takové rostliny by byly získávány transformací po vložení specifických genů
pro tvorbu bílkovin nebo peptidů, které se účastní vazby a transportu xenobiotik nebo zvýšením
produkce a aktivity rostlinných bidegradačních enzymů a zajištění jejich přednostního transportu do
rhizosféry a podpory půdních bakterií, které žijí v nejbližším okolí rostlinných kořenů.
VII-80
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Lze tedy říci, že fytoremediace je metoda při níž dochází k odstraňování xenobiotik šetrně a poměrně
levně ve srovnání s fyzikálně-chemickými metodami. V příštích letech by se mohla stát velmi
využívanou metodou díky výhodám jež poskytuje.
Americká Společnost rostlinné fyziologie (ASPP) vypočetla před několika lety, že zavedené způsoby
dekontaminace půdy stojí přibližně 1000 dolarů/1 tunu půdy, zatímco přečištění pomocí fytoremediace
vyjde na 30 dolarů za tunu půdy. Tato čísla jsou průměrná a v každém jednotlivém případě je potřeba
přihlédnout k různým faktorům, jako jsou typ polutantu, půdní typ a rozloha kontaminovaného místa
atd. I přesto je fytoremediace významně levnější než běžné metody. Mezi zatím nejpoužívanější typy
fytoremediace patří fytoextrakce, hlavně pro transport a akumulaci kovů z půdy, a rhizofiltrace, při
které kořeny rostlin rostoucích ve vodě absorbují přítomné polutanty. Přímo pro tyto dvě metody
připravený rozpočet ukázal, že je potřeba počítat s 25 –100 dolary za tunu přečištěné půdy a 0,6 – 6,0
dolaru /1000 galonů (3 785 l) znečištěného vodního systému.
Oblasti kontaminované určitým typem organických látek nebo anorganických látek, vyžadují
specifický typ rostlin nebo větší počet rostlin ve skupině. Často se používá vojtěška pro svojí
schopnost fixovat dusík a vlastnostem kořenů, které zasahují do vhodné hloubky. Dále se pro
fytoremediace osvědčily stromy z rodu Salicaceae (topoly a vrby), které jsou značně odolné a
relativně rychle rostou. Řebříček vodní (vodní mor kanadský) byl využit pro odstraňování škodlivých
látek za spodních vod.
16.1.3.2
Ex situ metody
16.1.3.2.1 Bioremediace v suspenzním systému (slurry phase bioremediation)
Tato technologie byla úspěšně aplikována na dekontaminaci půd a kalů. Polutanty k jejichž odstranění
byl použit tento systém jsou následující: polyaromatické uhlovodíky, pesticidy, ropné uhlovodíky,
heterocyklické a chlorované aromatické sloučeniny. Poměrně široký rozsah látek, které lze tímto
způsobem odstraňovat ze životního prostředí, se odráží i v řadě konkrétních případů kdy byla
technologie použita. V modifikaci in situ, bioremediace v suspenzi v laguně (slurry lagoon
bioremediation), byla při čištění dosažena koncentrace pro vinylchlorid menší než 5 ppm a celkový
obsah PCBs, benzenu a benzo[a]pyrenu byl nižší než 10 ppm. Obvykle je technologie v suspenzním
systému prováděna jako vsádkový proces v reaktoru, kterým může být laguna, otevřené nádoby nebo
uzavřený systém. Prvním krokem při čištění je odtěžení půdy, odstranění velkých kamenů a příprava
vodní suspenze (60-95 váhových %). Po ukončení bioremediace se oddělí vodní a pevná fáze. Různé
typy suspenzních reaktorů se od sebe liší ve způsobu okysličování a způsobem míchání suspenze.
Výhody této bioremediační technologie spočívají v možnosti lepší a efektivnější kontroly procesu,
zajištění zvýšené rozpustnosti organických látek, homogenizaci pevných částic v suspenzi, zlepšeném
kontaktu mezi mikroorganismy a kontaminanty. Probíhá-li bioremediace v uzavřeném systému lze
zvýšit rozpustnost látek přídavkem surfaktantu a k urychlení procesu přispívá i dodávání živin a jejich
lepší distribuce event. přídavek vhodných mikroorganismů. Nevýhodou technologie jsou vyšší nároky
na energii, nutnost přemísťování zeminy a její úprava a separace vodního a pevného podílu suspenze
v závěru procesu. Finančně je tento způsob remediace náročnější než landfarming a kompostování, ale
je mnohem levnější než fyzikální způsoby dekontaminace a navíc je rychlejší.
16.1.3.2.2 Bioremediace v pevné fázi (solid phase bioremediation)
Land farming technologie se obvykle provádí přímo v povrchových vrstvách půdy (in situ - viz
Obrázek 16-3) anebo na separovaných dekontaminačních plochách. Kontaminovaná půda je
VII-81
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
dostatečně pohnojena N-P-K hnojivem, provlhčena a rozprostřena na nepropustnou podložku tak, aby
se vrstva zeminy pohybovala v rozmezí 40 - 60 cm. Při dostatečné katabolické aktivitě
mikroorganismů přirozeně osidlujících kontaminovanou zeminu se neprovádí žádná další inoulace
mikroorganismy. Půda je v průběhu dekontaminace provzdušňována přehazováním. Průběžně se
kontroluje vlhkost půdy, koncentrace živin a koncentrace polutantu. Technologie byla použita pro
čištění různých typů odpadů a pro odstraňování nebezpečných chemikálií.
Pro půdy kontaminované BTEX a PCBs lze využít pro dekontaminaci vanový reaktor (bed reactor)
(obrázek 16-3). Ten je umístěn v hale opatřené filtry pro zachycování případně vznikajících,
potenciálně toxických, těkavých produktů metabolické aktivity mikroorganismů. Kontaminovaná půda
nebo kal je umístěn do uzavřené vany (lože) s drenáží, která odvádí nebezpečný výluh pro další
zpracování např. v bioreaktorech. Kontaminovaná půda je vzdušněna systémem trubek aeračního
zařízení. Nad vanou je umístěn zavlažovací systém, který umožňuje případné dodávání dalších živin
nebo mikrobiální suspenze s odpovídající katabolickou aktivitou.
Obrázek 16-3: Schéma vanového reaktoru (bed reactor)
Obě uvedené technologie mohou být použity i pro sanaci kontaminovaných vod, kdy je voda
nastřikována na půdu, ve které probíhá vlastní degradace polutantu.
Při kompostování je kontaminovaný materiál míchán s organickým materiálem (sláma, piliny, kůra
aj.) a obohacen zdrojem N a P, případně dalšími anorganickými živinami. Materiál může být uložen
rotačních bubnech, cirkulačních tancích, otevřených nádobách, silech nebo na otevřené hromadách
(biopiles) nebo záhonech (windrow composting). V průběhu kompostování je materiál pravidelně
vlhčen a vzdušněn přehazováním, otáčením nebo vzdušnícím systémem. Teplota během procesu je
obvykle okolo 50-60oC. Proces může probíhat za aerobních nebo anaerobních podmínek. Během
posledních 25 let se kompostování stalo jednou ze základních technologií pro čištění městských
odpadů. Dále bylo popsáno využití této technologie pro odstraňování těžkých olejů, polyaromatických
uhlovodíků, chlorovaných fenolů a výbušnin (TNT, RDX, HMX).
16.1.4 Závěr
Všechny dosud popsané a používané bioremediační technologie nemají obecné, široké použití. Při
hledání metody pro odstraňování polutantů s určité lokality je nutné vycházet z kompletní
charakterizace znečištěné lokality a zvážit celou řadu kriterií, na jejichž základě lze vybrat metodu
vhodnou pro určitý případ. S ohledem na cílový kontaminant se při výběru vhodné remediační metody
sledují zejména celkové náklady na proces, minimální dosažitelná koncentrace polutantu, spolehlivost,
účinnost metody, náklady na úpravy po ukončení bioremediace, a také další možné využití vyčištěné
VII-82
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
půdy. Mimo tato kriteria je nutné brát do úvahy i to, jak by bylo zavedení vybrané metody
akceptováno širokou veřejností.
16.2 Polychlorované bifenyly
16.2.1 Úvod
Vzhledem k fyzikálně-chemickým vlastnostem je degradace PCBs fyzikálně - chemickými metodami
značně náročná, a hlavně drahá. Jednou z možných metod je spalování PCBs ve vysokých
martinských pecích za vysokých teplot (nad 1 300 °C). V podmínkách, které jsou v současné době v
České republice, je tento postup prakticky nerealizovatelný. Hlavním důvodem je nutnost udržení
konstantní teploty, aby spalováním nedošlo ke vzniku ještě toxičtějších látek - dioxinů, tento
požadavek s sebou nese značnou finanční náročnost celé technologie. Alternativní využití
mikroorganismů (vhodnými adepty bioremediace jsou některé druhy půdních bakterií a
ligninolytických hub a některých druhů rostlin) se jeví jako ekologicky šetrné a z hlediska finančních
nákladů výhodné řešení.
16.2.2 Bakteriální degradace PCBs
Mikroorganismy, a to především aerobní a anaerobní bakterie, byly studovány jako jedny z prvních
organismů s ohledem na jejich schopnosti degradovat PCBs (původně považováné za látky vůči
mikrobiální transformaci rezistentní). Za anaerobních podmínek podléhají PCBs redukční
dechlorinaci, při které dochází k odstraňování chloru z více chlorovaných kongenerů v polohách meta
a para, čímž dochází ke snižování toxicity a ke kumulaci ortho-chlorovaných mono-, di- a
trichlorbifenylů. Chlor je na bifenylovém jádře nahrazen vodíkem. Vzniklé níže chlorované kongenery
mohou být degradovány aerobními bakteriemi. Při tomto aerobním metabolismu dochází
k oxidačnímu ataku bifenylového jádra a k jeho následnému rozštěpení za vzniku chlorbenzoových a
5-C chloralifatických kyselin.
Některé bakterie jsou schopné za aerobních podmínek degradovat PCBs na vodu a kysličník uhličitý.
Ačkoliv monochlorbifenyly mohou pro některé druhy bakterií sloužit jako zdroj uhlíku a energie,
kongenery obsahující dva a více atomů chloru jsou transformovány prostřednictvím kometabolismu.
Při kometabolismu slouží např. bifenyl jako zdroj uhlíku a zároveň jako induktor enzymů degradační
dráhy PCBs. Úplná mineralizace PCBs vyžaduje přítomnost dvou sad genů, které kodují transformaci
PCBs na chlorbenzoáty, respektive degradaci chlorbenzoátů. V přírodě se tyto sady genů obvykle
nevyskytují v jednom organismu, a proto pro kompletní mineralizaci je nutná přítomnost více
bakteriálních kmenů. S hlediska praktického využití to pro biodegradaci PCBs znamená aplikaci
směsných kultur. V naší laboratoři byla experimentálně, za optimalizovaných podmínek (poměr počtu
buněk obou kmenů, doba jejich inokulace apod.), ověřena účinnost aplikace směsi bifenylového a
chlorbenzoátového kmene na degradaci PCBs. Vytvořením mikrokosmu kmenů bakterií schopných
degradovat kongenery PCBs a chlorbenzoáty lze dosáhnout mineralizace 2-chlor-; 3-chlor-; 4-chlor-;
2,4-dichlor- nebo 3,5-dichlorbifenylů. Avšak aplikace této směsi bakterií na kontaminovanou půdu
nebo vodu v reálných podmínkách nezaručuje dodržení stejných podmínek a tudíž i dosažení
uspokojivých výsledků. Jednou z dalších možností je příprava rekombinantních kmenů bakterií
nesoucích kompletní genetickou výbavu nutnou pro degradaci PCBs. Takové kmeny byly sestrojeny
v několika laboratořích, ale jejich použití naráží na na řadu problémů. Mimo stabilitu kmene a
schopnost přežití těchto buněk v reálných podmínkách v soutěži s běžnou mikroflórou, je to i
legislativa, která by užívání takových kmenů povolila.
VII-83
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16.2.2.1 Metabolická dráha PCBs
Zásadní a také nejprostudovanější metabolickou dráhou aerobní degradace bifenylu a PCBs půdními
bakteriemi je čtyřstupňový proces (bph operon) zahajovaný oxidací v nesubstituovaných polohách 2 a
3 (nebo 5, 6) nechlorovaného nebo méně chlorovaného kruhu (I) (obrázek 16-4). Tento iniciační krok
realizuje enzym bifenyl-2,3-dioxygenasa. Vzniklý intermediát je dehydrogenován bifenyldihydrogendiol-dehydrogenasou na 2,3-dihydroxybifenyl, který podléhá tzv. meta-štěpení 2,3dihydroxybifenyl-dioxygenasou. Tento třetí krok je klíčový pro degradaci PCBs, protože dochází
k otevření bifenylového kruhu.
V posledním kroku katalyzovaného hydroxylasou dochází ke vzniku chorbenzoátu a pentadienové
kyseliny. Bifenyl-2,3-dioxygenasa je rozhodující enzym při degradaci PCBs, protože jeho specifita
určuje pořadí degradovatelnosti jednotlivých kongenerů. Na základě tohoto zjištění vyvodil Furukawa
pět základních principů degradace PCBs, založených na vztahu mezi strukturou kongenerů a jejich
biodegradabilitou:
•
•
•
•
•
biodegradabilita klesá se stoupajícím počtem atomů chloru,
dva atomy chloru v polohách ortho (tzn. 2,6- a 2,2´-) zvyšují rezistenci k biotransformaci,
kongenery s nesubstituovaným kruhem jsou obecně transformovány rychleji než kongenery se
substitucí na obou kruzích,
tetra- a pentachlorbifenyly jsou transformovány mnohem snadněji, když jeden z kruhů je
substituován v polohách 2 a 3,
iniciační oxidace obvykle probíhá na méně substituovaném kruhu.
Poloha substituentů na metabolizovaném kruhu zvyšuje účinnost biodegradace v pořadí: ortho > meta
> para.
VII-84
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
Cl
I
O2
bphA
Cl
II
OH
H H
OH
+
NAD
bphB
+
NADH + H
Cl
III
OH
OH
O2
bphC
Cl
IV
O
OH
COOH
H2 O
bphD
Cl
OH
+
V + VI
COOH
COOH
Obrázek 16-4: Metabolická dráha bifenylového operonu (bph)
VII-85
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Touto cestou dochází k transformaci méně substituovaných kongenerů. Byly však isolovány a popsány
bakteriální kmeny schopné degradovat široké spektrum PCBs: Acinetobacter sp. P6, Corynebacterium
sp. MB1, Alcaligenes eutrophus H850 a Pseudomonas sp. LB400. Kmen Acinetobacter sp. P6 při
růstu na bifenylu nebo 4-chlorbifenylu může oxidovat široké spektrum PCBs kongenerů
(tetrachlorbifenyly, některé pentachlorbifenyly a hexachlorbifenyly). Mohou být oxidována i některá
disubstituovaná jádra, významná jsou ta se substitucí v polohách 2,3 a 3,4, ale žádný z těchto kmenů
není schopen oxidovat jádra trisubstituovaná. Bakteriální kmeny Alcaligenes eutrophus H850 a
Pseudomonas sp. LB400 byly vyizolovány v různých obdobích a z různých lokalit, přesto mají
nápadně podobné kongenerové specifity. Oba kmeny vykazují velkou schopnost degradovat
kongenery se substitucí v polohách 2; 2,4; 2,5; 2,3,6 a 2,4,5. Díky tomu degradují mnoho tetra- a
pentachlorbifenylů a některé hexachlorbifenyly. Kromě toho však mohou oxidovat i 2,5,2´,5´tetrachlorbifenyl, tedy kongener, který má substituované 2,3 polohy, což vedlo k závěru, že kromě 2,3dioxygenasy mají tyto dva kmeny ještě 3,4-dioxygenasu. Kongenerová selektivita 3,4-dioxygenasy je
odlišná od 2,3-dioxygenasy, a proto pro tuto cestu platí odlišné obecné principy založené na vztahu
mezi strukturou kongeneru a jeho biodegradabilitou:
•
•
•
•
•
tetra- a pentachlorbifenyly substituované v polohách 2,5 jsou degradovány více než méně
chlorované kongenery substituované v obou para polohách (polohy 4,4´),
mnoho di-ortho-substituovaných kongenerů (2,2´-dichlor-; 2,3,6- a 2,5,2´-trichlor- a 2,5,2´,5´tetrachlorbifenyly) a několik tri- a tetra-ortho-substituovaných kongenerů (2,4,6,2´,5´pentachlor-; 2,3,5,6,2´,5´- a 2,3,6,2´,3´,6´-hexachlorbifenyly) je degradováno rychleji,
vícechlorované bifenyly substituované v polohách 2 a 3 jsou méně přístupné k degradaci než
ty, které jsou substituované v polohách 2 a 5,
kongenery s nesubstituovaným kruhem jsou obecně transformovány rychleji než kongenery
se substitucí na obou kruzích,
2,4,4´- a 2,5,4´-trichlorbifenyly jsou degradovány cestou ataku a štěpení disubstituovaného
kruhu za vzniku stejného produktu: 4-chlorbenzoátu.
16.2.2.2 Metabolická dráha chlorbenzoových kyselin
Chlorbenzoové kyseliny vznikají jako majoritní metabolit při biodegradaci PCBs. Do životního
prostředí však vstupují ze tří zdrojů: 1) jako herbicidy 2) jako produkty degradace herbicidů 3) jako
produkty degradace PCBs. Chlorbenzoáty jsou metabolizovány na nejrůznější produkty. Existují tři
mechanismy aerobního metabolismus chlorbenzoátů. Průběh této metabolické dráhy souvisí s původní
strukturou PCBs a substrátovou specifitou příslušných bakterií (obrázek 16-5):
•
•
•
chlorbenzoáty substituované v poloze ortho(X) jsou atakovány iniciační o-chlorbenzoát-1,2dioxygenasou (OCBD). Druhý krok, při němž je samovolně uvolňován CO2 a HCl(XI)
(dehalogenační dekarboxylace), probíhá spontánně za vzniku 1,2-benzendiolu(XII),
chlorbenzoáty substituované v para poloze(XIII) jsou hydrolyticky dehalogenovány
(dehalogenasa) přes 4-chlorbenzoylCoA(XIV) na 4-hydroxybenzoylCoA(XV), který
hydrolyzuje na 4-hydroxybenzoát(XVI), který je monooxygenasou hydroxylován na
protokatechát(XVII),
chlorbenzoáty substituované v poloze meta(XVIII) jsou účinkem dioxygenasy (benzoát-1,2dioxygenasa) oxidovány a dekarboxylovány(XIX) na chlorbenzendioly(XX), které jsou dále
metabolizovány tzv. modifikovanou ortho dráhou na 2-chlor-cis,cis-mukonovu kyselinu(XXI)
spontánně cyklizující na cis-5-karboxy-2,4-pentadien-4-olid(XXII).
Zajímavé je, že chemicky by dehalogenace probíhala při extrémních podmínkách (koncentrovaný
NaOH, 300 °C) u bakterií (např. Pseudomonas sp. CBS3) probíhá za fysiologických podmínek.
VII-86
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
COOH
Cl
cbdABC
a)
X
OH
OH COOH
Cl
NADH + H ++ O2
OH
OH
NAD
+
CO2 + HCl
XI
COOH
XII
COSCoA
COSCoA
CoASH
dehalogenasa
b)
ATP
Cl
AMP + PP i
H2 O
Cl
HCl
OH
XIII
XIV
XV
COSCoA
COOH
COOH
monooxygenasa
OH
OH -
OH
CoASH
XV
COOH
OH
OH
XVI
XVII
OH
OH COOH
H
c)
Cl
Cl
Cl
+
NADH + H + O2
XVIII
OH
OH
clcABC
NAD
+
CO2
XIX
XX
OH
COOH
OH
COOH
COOH
Cl
O
Cl
HCl
XX
XXI
O
XXII
Obrázek 16-5: Metabolismus chlorbenzoátů
a) ortho dráha
b) para dráha
c) meta dráha
VII-87
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Existují však bakteriální kmeny, které dokáží degradovat široké spektrum chlorbenzoových kyselin a
využívají k tomu více drah najednou. To znamená, že takový kmen je schopen použít k degradaci
chlorbenzoátů například ortho dráhu i meta dráhu. Mezi nejvíce prostudované bakteriální kmeny s
těmito schopnostmi patří Pseudomonas aeruginosa JB2 a Pseudomonas putida P111.
Schopnost bakteriálních kmenů degradujících PCBs metabolizovat také chlorbenzoáty byla objevena
také u směsných kultur. Například směsná kultura označená MIXE1 a skládající se z bakteriálních
kmenů Pseudomonas a Alcaligenes, které byly schopné degradovat nízkochlorované kongenery
v přítomnosti 4-chlorbifenylu jako kosubstrátu degradovala i vybranou směs mono- a dichlorbenzoátů.
Vedle diskutovaných výsledků bylo však také prokázáno, že při přeměně chlorbenzoátů v půdních
mikrokosmech může vedle mineralizace dojít ke tvorbě protoanemoninu - antibiotika rostlinného
původu, jehož toxicita má zcela zásadní vliv na přežívání mikroorganismů v půdě.
Kromě gramnegativních bakterií schopných degradovat chlorbenzoáty (převážně rodu Pseudomonas)
existují i grampozitivní bakterie s touto schopností. Patří mezi ně i Rhodococcus oparus GM-14,
aktinomyceta, které využívá jako jediný zdroj uhlíku široké spektrum halogenovaných aromatických
sloučenin. Kromě derivátů benzenu a fenolu mezi ně také patří deriváty benzoátu, zejména pak 3chlorbenzoát.
16.2.2.3 Možnosti přípravy rekombinantních kmenů bakterií degradujících PCBs
Jak již bylo uvedeno výše, jednou z možností zvýšení biodegradační aktivity u mikroorganismů je
příprava geneticky modifikovaných kmenů. Divoké bakteriální kmeny izolované z půd
kontaminovaných PCBs, u nichž byla prokázána značná schopnost utilizovat PCBs nebo produkty
jejich metabolismu, mají z hlediska genových manipulací několik, ve svém důsledku však negativních
vlastností, např. rezistenci k široké škále antibiotik, velmi dlouhou lag-fázi v laboratorních
podmínkách a přítomnost velkých - často špatně izolovatelných plasmidů. Tyto negativní vlastnosti
jsou potlačeny konstrukcí rekombinantních kmenů bakterií, z nichž lze získat požadovanou DNA ve
vhodné koncentraci a maximální čistotě. Takto získaný genetický materiál je používán ke konstrukci
bakteriálních kmenů schopných degradace PCBs v přírodních podmínkách.
Horizontální genový přenos je jednou z možností aplikace takto zkonstruovaných rekombinantních
bakteriálních kmenů v životním prostředí. Jedná se o transfer schopnosti degradovat polutanty na
původní bakteriální kmeny, které tyto schopnosti před aplikací s konstrukty neměly. Přenos genetické
informace je realizován třemi mechanismy: a) transformací, b) transdukcí, c) konjugací. Konjugace je
uplatňována nejvíce, její úspěšnost závisí na mnoha faktorech, především na charakteru donorového a
recipientního kmene, na vlastnostech samotného plasmidu a na podmínkách kultivace. Důkazem
horizontálního přenosu velkých katabolických plasmidů v půdě je úspěsná konjugace 80kb plasmidu
pJP4 kmene Alcaligenes eutrophus JMP134, který degraduje 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinu do
recipientních organismů v nesterilní půdě v mikrokosmu, které tuto degradační schopnost nemají.
Ověření přenosu byla v tomto případě rezistence ke rtuti nesené plasmidem pJP4, kterou původní
divoká kultura získala a která u ní před přenosem nebyla zjištěna. Díky horizontálnímu přenosu
plasmidu pJP4 stoupla v mikrokosmu rychlost degradace 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny.
Pro detekci bakteriálních kmenů inokulovaných do mikrokosmu je vhodné použit bioluminiscenčních
markerů obsahujících geny pro emisy světla. Spojení obou vlastností - degradačních a detekčních je
možné dvěma způsoby, a to buď vnesením bioluminiscenčních markerů do bakteriálních kmenů s
degradačními schopnostmi, nebo vnesením katabolických konjugativních plasmidů s geny pro
biodegradaci i bioluminiscenci do nových bakteriálních kmenů.
VII-88
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
Do chromozomu bakteriálního kmene Pseudomonas fluorescens byl naklonován lux operon s geny
kódujícími bakteriální luciferasu. Tento rekombinantní kmen byl využit pro oba typy spojení
degradačních a detekčních vlastností. Bakteriální luciferasa je enzym izolovaný z organismů: Vibrio
fischeri, Photobacterium leiognati, Vibrio harveyi a Xenorhabdus luminiscens. Geny luxAB byly
vneseny do bakteriálního kmene Alcaligenes eutrophus H850, který byl aplikován při studiu přenosu
bph genů mezi půdními bakteriemi vysetými do mikrokosmu. Byl pozorován vliv typu půdy na
horizontální přenos bph genů a na přežití H850Lr. Opačným příkladem využití lux genů jako markeru
je vnesení katabolického konjugativního plasmidu pPB111 z kmene Pseudomonas putida P111
nesoucího geny pro chlorbenzoát-1,2-dioxygenasu do recipientního kmene Pseudomonas fluorescens,
do kterého byl předtím transformací přenesen Tn7-luxCDABE marker. Bioluminiscenční aktivita
rekombinantního kmene Pseudomonas fluorescens 2-79 RLD, míra jeho vitální schopnosti a
fyziologického stavu v půdě, byla monitorována měřením produkce světla vzorků půdy mikrokosmu.
Dalším typem markeru vhodného pro značení gramnegativních bakteriálních kmenů je green
fluorescent protein (GFP), izolovaný z organismu Aequorea victoria, se silnou viditelnou absorbancí a
fluorescencí z p-hydroxybenzylidenimidazolidinonového chromoforu. Tento protein má mimořádný
význam při monitorování genové exprese a lokalizaci proteinů v žijících buňkách, protože detekce
intracelulárního GFP vyžaduje expozici pouze v blízkosti UV nebo modrého světla, není tedy
limitována použitím žádného bioluminiscenčního substrátu. Protože nebyla objevena interference s
buněčným růstem a funkcí, může být GFP použit jako indikátor transformace, a také být jedním z
markerů, který umožňuje selekci buněk na základě fluorescenční aktivity. GFP je vitálním markerem,
takže vypovídá i o pohybu a buněčném růstu in situ.
16.2.2.4 Výzkum biodegradační aktivity bakterií
V České republice je pouze omezený počet pracovišť, které by se zabývaly a studiem biologických
systémů schopných degradovat PCBs. Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha má v tomto
ohledu za sebou již několik let výzkumu v této oblasti. Jako degradační organismy byly použity
bakterie a rostliny ( spolupráce s ÚOCHB AV ČR).
Ze vzorků kontaminovaných půd z různých lokalit v ČR byly isolovány konsorcia bakterií schopných
růstu na bifenylu, které byly po adaptační fázi testovány s ohledem na jejich schopnosti degradovat
PCBs.
Později byla pro screening kmenů zavedena metoda umožňující stanovit schopnost degradovat PCBs
přímo na tuhých mediích z bifenylem. Metoda spočívá v postřiku narostlých kolonií 4-brombifenylem
v etheru. Kolonie schopné degradace kolem sebe vytváří průhlednou zonu během 24-48 hodin.
V průběhu posledních let bylo isolováno několik mikrobiálních konsorcia/nebo isolátů schopných
s vyšší či nižší účinností degradovat PCBs. Směs dvou isolátů bakterií byla aplikována při ověřovacím
pokuse v Žamberku, kde na základě povolení SZÚ bylo v roce 1995 prováděno odstraňování PCBs ze
spodních vod (viz dále).
Při mikrobiologickém rozboru vzorku hlíny odebrané na skládce v Lhenici bylo zjištěno, že v půdě
jsou zastoupeny aerobní, anaerobní a sporulující bakterie (tabulka 16-1, obrázek 16-6). Růstem na
selekčním mediu byla prokázána přítomnost pseudomonád, které mají obecně širokou schopnost
degradovat organické látky.
VII-89
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
Tabulka 16-1: Počty bakterií isolovaných z 1g nevegetované půdy kontaminované PCBs na skládce
v Lhenici
Bakterie
Vzorek 1
-1
Vzorek 2
počet bakterií.g půdy
počet bakterií.g-1 půdy
Celkový počet MO
2,1 x 107
3,9 x 107
Anaerobní
2,0 x 105
3,6 x 105
Aerobní sporulující
3,5 x 105
4,9 x 105
0
0
Koliformní
Bakterie rodu Pseudomonas
3,9 x 10
6
8,3 x 106
Isolované konsorcium bakterií bylo použito pro degradaci PCBs. Výsledek je uveden na obrázku 16-7
(Pomocí GC bylo stanoveno 22 píků, z nichž každý representuje jeden až tři individuální kongenery.
zbytkové koncentrace PCB (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
číslo píku
Obrázek 16-6: Degradace PCBs mikrobiálním konsorciem isolovaným z kontaminované půdy
Inkubace probíhala 14 dní, s 50 µg.ml-1 PCBs při 28 °C.
Z konsorcia byly isolovány jednotlivé kmeny a ty byly identifikovány jako:
Pseudomonas fluorescens, Ps. stutzeri, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. alcaligenes, Ps. fragi, Burkholderia
sp, Burkholderia pickettii, Alcaligenes xylooxidans
Schopnost isolovaných bakterií degradovat PCBs byla za laboratorních podmínek sledována
v minimálním tekutém kultivačním mediu obsahujícím jako jediný zdroj uhlíku a energie bifenyl (50
mg.l-1) a komerční preparát PCB Delor 103 (50 mg.l-1). Dále byly studovány optimální podmínky
degradace, možnost náhrady bifenylu jako zdroje uhlíku a energie jiným substrátem.
Některé z výše uvedených bakterií byly schopné růst v přítomnosti bifenylu, avšak schopnost
degradace PCBs jednotlivými isoláty byla ve srovnání s konsorciem poměrně nízká. Pravděpodobným
důvodem může být skutečnost, že jednotlivé isoláty nemají při testování biodegradačních schopností
podporu ostatních mikrobiálních druhů přítomných v konsorciu. Tento předpoklad podporují i
výsledky dalšího testování vlastností isolovaných bakterií, u nichž kromě výše uvedené schopnosti
VII-90
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
degradovat PCBs, byla testována i schopnost růst v přítomnosti chlorbenzoových kyselin jako
jediného zdroje uhlíku a energie. V případě mikrobiálních konsorcií může přítomnost bakterií s touto
aktivitou hrát klíčovou úlohu, protože tyto bakterie snižují koncentraci chlorbenzoátů, vzniklých
z PCBs, a inhibujících průběh horní degradační dráhy. V našem případě byla schopnost využívat
chlorbenzoové kyseliny nalezena u některých sporulujících bakterií (pravděpodobně rodu Bacillus),
získaných z téhož zdroje, a potvrdila se i jejich schopnost některé chlorbenzoové kyseliny degradovat.
Výše popsaná zjištění se potvrdila i v případě dalších vzorků kontaminované půdy. Studie opět
potvrdily, že bakteriální konsorcia vykazují vyšší schopnost degradovat PCBs než jediný kmen.
V několika případech se přesto kultivací pod selekčním tlakem bifenylu podařilo isolovat jednotlivé
kmeny s dobrými degradačními schopnostmi. Byl vybrán jeden isolát vykazující poměrně vysokou
schopnost degradovat PCBs, který byl nejdříve s využitím klasických biochemických testů, později i
analysou 16S rRNA identifikován jako Pseudomonas sp. P2 a byl používán k dalším fyziologickým,
biochemickým a genetickým studiím.
16.2.3 Degradace PCBs houbami bílé hniloby
Určité podobnosti s bakteriální degradací PCBs byly zaznamenány i při degradaci houbami bílé
hniloby. Tyto houby primárně degradují lignin a polymery skládající se z různých skupin, ve kterých
se objevuje i bifenyl. V přírodě houby produkují řadu enzymů peroxidásového typu, které degradují
lignin a uvolňují celulosu, sloužící houbám jako zdroj energie a uhlíku. Jedním z hlavních rozdílů
mezi bakteriální a houbovou degradací PCBs je to, že houby jsou schopné degradovat širší rozsah
kongenerů PCBs než bakterie a produkují výlučně monooxygenásy (bakterie dioxygenasy).
Dřevokazná houba Phanerochaete chrysosporium je schopna degradovat i výše chlorované bifenyly,
avšak jen v nízkých koncentracích. Stejně jako u bakterií závisí schopnost degradace na počtu chlorů
na bifenylovém jádře. Mechanismus, kterým houby štěpí bifenylový kruh není zatím popsaný, málo
informací je i o možných metabolických intermediátech.
Ačkoliv houby bíle hniloby prokázaly schopnost účinně degradovat PCBs za laboratorních podmínek,
jejich aplikace v bioremediačních technologiích na čištění zkontaminované hlíny naráží na to, že
přirozeným substrátem pro tyto houby je dřevo a v půdě samotné mají velmi nízkou PCB
biodegradační aktivitu. Tento problém se snaží odstranit studie zaměřené na aplikaci hub na nosičíchpřirozených substrátech.
16.2.4 Metabolismus PCBs u rostlin
Rostliny odbourávají PCBs jiným mechanismem a o produktech tohoto odbourávání je známo
poměrně málo. Na rozdíl od bakterií a živočichů nebyl dosud prováděn žádný systematický výzkum
schopnosti různých rostlinných druhů metabolizovat PCBs. Hlavním předpokládaným mechanismem
uplatňujícím se v metabolismu PCBs v savčích buňkách je reakce katalyzovaná enzymem
monooxygenasou (isoenzymy cytochromu P 450) a vznik intermediátů – arenoxidů. Během následné
reakce pak může dojít i k přesmyku a výměně posice Cl a OH skupin. Tak byly identifikovány
metabolity 4,4´-dichlorbifenylu jako 4,4´-dichlor-3-hydroxybifenyl, 3,4´-dichlor-4-hydroxybifenyl a
4´-chlor-4-hydroxybifenyl. V nedávné době byl potvrzen další neenzymatický vznik fenylbenzochinonů, které mohou, jak již bylo výše uvedeno, přispívat k oxidativnímu stresu.
První zmínky o přeměně PCBs rostlinnými buňkami se objevily v 70. letech a jako první krok
přeměny PCBs byla zjištěna hydroxylace. Tím se rostlinný metabolismus podobá i metabolismu
živočišnému. Při dalším studiu vznikajících hydroxyderivátů byla vyslovena hypotéza, že kongenery
s chlorem v ortho poloze podléhají přeměně v rostlinných buňkách snadněji než ostatní kongenery.
VII-91
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
V našich pokusech jsme sledovali přeměny monochlorbifenylů a dichlorbifenylů nejprve buňkami
kultury lilku - Solanum nigrum SNC-90. U dichlorbifenylů pokusy potvrdily účinnější metabolisaci
kongenerů s chlorem v ortho-poloze. Naopak ze tří existujících monochlorbifenylů byl nejsnadněji
metabolisován 4-chlorbifenyl. V další fázi těchto pokusů byla sledována přeměna monochlorbifenylů
čtyřmi kulturami rostlinných buněk (Solanum nigrum SNC 90 – lilek černý, Armoracia rusticana K 54
– křen selský, Nicotiana tabacum - tabák viržinský, Medicago sativa – vojtěška setá) a srovnáním se
standardy identifikovány jako metabolity některé hydroxychlorbifenyly.
Kromě hydroxychlorderivátů byly pomocí GC-MS identifikovány další možné produkty vznikající
přeměnou PCBs - benzoová kyselina, chlorbenzoová kyselina, hydroxybifenyly i bifenyl. Z výsledků
vyplynulo, že různé rostlinné druhy mohou metabolisovat tytéž PCBs na strukturně odlišné
chlorhydroxyderiváty; 4-chlorbifenyl může být metabolisován na různé produkty, avšak 4-chlor-4´hydroxybifenyl vzniká v každém případě; během přeměny může dojít k přesmyku a přesunu polohy
chloru (což bylo publikováno i dříve, jak u živočišných buněk, tak u buněk rostlinných). Přeměnou
PCBs rostlinnými buňkami mohou vznikat látky s jednodušší strukturou, které byly identifikovány i u
mikroorganismů. Z tohoto faktu plyne i velká pravděpodobnost účasti jiných enzymových systémů
než monooxygenasy cytochromu P450. Vzhledem k podobnosti intermediátů mikrobiální degradace
PCBs s produkty metabolismu rostlin, existuje velká pravděpodobnost, že rostlinné produkty PCBs
jsou pro bakterie snadněji dostupné a lépe degradovatelné substráty.
16.2.5 Vzájemná interakce bakterií a rostlin při degradaci PCBs
V přírodě se na metabolismu xenobiotik podílí řada biologických systémů. Všechny organismy
existují v úzké vazbě se svým abiotickým i biotickým prostředím. Významné jsou především vazby,
které přímo souvisí se zajištěním výživy, rozmnožováním a jak se v poslední době prokázalo i
s metabolismem xenobiotik a detoxifikací prostředí. Jak bylo již výše uvedeno, v minulosti byly
chování a vlastnosti jednotlivých typů organismů z hlediska jejich schopností metabolisovat
xenobiotika studovány odděleně a bez hledání souvislostí a vzájemného ovlivňování.
Jako základní funkce mikroorganismů v tomto směru lze formulovat:
•
•
•
modifikace rhizosfery, produkce nejrůznějších enzymů a látek, které mohou positivně
ovlivňovat růst rostlin,
uzpůsobení prostředí deficientního na živiny,
ovlivnění schopností zvýšeného příjmů některých minerálů rostlinami.
Úloha rostlin spočívá v:
•
•
•
•
produkci exudátů, které obsahují látky působících jako zdroj uhlíku a energie a dalších živin
pro mikroorganismy,
produkci látek, které mohou sloužit jako induktory mikrobiálních degradačních genů,
zadržování a příjmu vody,
produkci oxidu uhličitého a ovlivnění tense kyslíku.
Z literatury je dále známo, že tzv. allelopatické vztahy organismů jsou i v nekontaminované přírodě
klíčové a hrají positivní i negativní úlohu. Přenos informací se děje pomocí produkce specifických
chemických sloučenin, které jsou vylučovány do okolního prostředí. Za allelochemikálie jsou
považovány mnohé sekundární metabolity, jako fenoly, flavony, isoflavony, alkaloidy, fytoalexiny,
terpeny, mastné kyseliny atd., které se do prostředí dostávají z nadzemních částí rostlin, kořenovými
exudáty a rozkladem rostlinné biomasy.
VII-92
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
V nedávné době se řada vědeckých pracovišť začala zabývat i otázkou vzájemného ovlivňování
organismů, jejich vztahy v kontaminovaném prostředí a jejich úlohou při odstraňování kontaminantů
anorganického i organického původu. V otázce biodegradace PCBs byla významným a dosud
nezodpovězeným problémem indukce mikrobiálních genů kodujících degradaci PCBs. V laboratoři se
jako zdroj uhlíku a současně induktor používá bifenyl, který je málo rozpustný a též sám o sobě
toxický a v případě velkých objemů kontaminované půdy je obtížně použitelný. Jednou z možností je
využití schopnosti některých látek rostlinného původu, uvolňovaných do půdy, působit podobně jako
bifenyl. Donelly a kol. (1994) testovali tři bakteriální kmeny Pseudomonas sp. LB 400,
Corynebacterium sp. MB1a Alcaligenes eutrophus H850 s ověřenými degradačními vlastnostmi
v přítomnosti bifenylu, z hlediska jejich schopnosti růstu a degradace PCBs v minimálním mediu a
v přítomnosti některých rostlinných terpenů a flavonoidů jako jediných růstových látek a induktorů
degradace PCBs. Bakterie byly schopné odlišně využívat tyto látky. Růst a srovnatelná degradace jako
s bifenylem byla zjištěna např. s katechinem, naringinem, myricetinem, nebo floridzinem. Obdobně
Gilbert a Crowley (1997) testovali degradační schopnosti bakterie Arthrobacter sp. B1B v přítomnosti
terpenů. Zjistili, že buňky vykazují nejvyšší schopnost degradovat PCBs v přítomnosti karvonu. Jako
zdroj uhlíku byla v tomto případě do media přidávána fruktosa, karvon byl použit jako induktor
exprese genů bph operonu. Podobný efekt způsobovaly přídavky limonenu, isopropylbenzenu a
cymenu.
V našem případě jsme testovali některé látky fenolické povahy – kyseliny vanilovou, ferulovou,
skořicovou a flavonoidy quercetin a morin ve třech koncentracích 0.2, 1, 2 g.l-1. Byly použity dva
bakteriální kmeny, již výše popsaný Pseudomonas sp. P2 a Pseudomonas stutzeri 12, které byly
testovány z hlediska schopnosti růstu a degradace PCBs v přítomnosti výše zmíněných látek, jako
jediného zdroje uhlíku a energie a možného induktoru genů bph operonu.
Buňky bakterie Ps. sp. P2 vykázaly relativně dobrý růst na všech substrátech kromě kumarinu.
Růstové vlastnosti bakterie a schopnost využívat zvolené látky jako jediný zdroj uhlíku a energie
v koncentraci 0,2 g.l-1 vyjadřuje tabulka 16-2.
Tabulka 16-2: Růstové charakteristiky kmene Pseudomonas sp. P2 v přítomnosti různých substrátů
v koncentraci 0,2 g.l-1
Použitá látka
µ [hod-1]
T [hod]
6,8 x 10
-3
102
Kumarin*
0
0
Kyselina ferulová
1,3 x 10
-3
531
3,9 x 10
-3
177
2,8 x 10
-3
246
(R)-(+)-limonen
1,6 x 10
-3
431
(S)-(−)-limonen
1,5 x 10-3
460
7,5 x 10
-3
92
11,2 x 10
-3
62
Bifenyl
Kyselina skořicová
Kyselina vanilová
Morin
Quercetin
Pozn: µ – specifická růstová rychlost, T – generační doba
* - lyse buněk
Výše uvedený pokus prokázal schopnost bakterie Pseudomonas sp. P2 využívat kromě bifenylu i další
látky, fenolické kyseliny, flavonoidy jako jediný zdroj uhlíku a energie. V další fazi byla sledována
VII-93
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
schopnost bakterie Pseudomonas sp. P2 degradovat PCBs v přítomnosti těchto látek a srovnávána
s degradací v přítomnosti bifenylu.
Tabulka 16-3 shrnuje výsledky průměrné degradace PCBs buňkami bakterie Ps. sp. P2 v přítomnosti
různých substrátů (včetně terpenů limonenu a kumarinu). Z tabulky je zřejmé, že buňky použité
bakterie jsou schopné degradovat PCBs nejen v přítomnosti bifenylu jako kosubstrátu, ale i
v přítomnosti dalších aromatických látek rostlinného původu. Tento fakt podporuje hypothesu, že
v přírodě, kde se tyto látky vyskytují přirozeně, mohou sloužit nejen jako substrát pro růst, ale mohou
být důležité jako ko-substráty při degradaci polychlorovaných bifenylů.
Další možnost ověření hypothesy poskytly následující pokusy, kdy byla testována degradační
schopnost Ps. sp. P2 v přítomnosti koncentrovaných extraktů získaných z rostlinných buněk a při
následné a společné kultivaci rostlinných a bakteriálních buněk v mediích, která obsahovala PCBs,
avšak neobsahovala bifenyl. Výsledky následné kultivace jsou uvedeny na obrázku 16-7. Naměřený
zůstatek PCBs po následné kultivaci oproti výchozí koncentraci byl 66%, po společné kultivaci
rostlinných a bakteriálních buněk byl stanoven zůstatek PCBs 67%.
Tabulka 16-3: Bakteriální degradace PCBs přítomných ve směsi Delor 103 v přítomnosti kosubstrátů
kmenem Pseudomonas sp. P2
Použitá látka
Zůstatek D 103 v %
Bifenyl
49
Kumarin
96
Kyselina ferulová
28
Kyselina skořicová
44
Kyselina vanilová
23
(R)-(+)-limonen
82
(S)-(−)-limonen
70
Morin
36
Quercetin
20
Pozn.: Každý z degradačních pokusů s uvedenými induktory byl proveden 2x nezávisle na sobě a procentuální
hodnota zůstatku byla vypočtena jako jejich aritmetický průměr.
VII-94
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
zůstatek po degradaci (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22
Číslo píku
Obrázek 16-7: Degradace PCBs buňkami bakterie Pseudomonas sp. P2 v odfiltrovaném inkubačním
mediu po předcházející kultivaci rostlinných buněk kultury hairy root SNC 90 bez přídavku bifenylu,
kultivace rostlinných buněk – 14 dní, kultivace bakteriálních buněk – 14 dní, přídavek Deloru 103 do
odfiltrovaného media před přídavkem bakteriálního inokula – 25 µg.ml-1
Kromě společné nebo následné kultivace byl do minimálního media pro kultivaci bakteriálních buněk
Ps. sp. P2 přidáván rostlinný extrakt. Po přídavku koncentrovaného extraktu získaného extrakcí
ethylacetátem, nebo dichlormethanem byly zjištěny zůstatky PCB 42%, respektive 21%.
Analysa HPLC potvrdila, kromě řady dalších látek i přítomnost některých fenolických kyselin, které,
jak bylo výše uvedeno, mohou být nejen zdrojem uhlíku pro bakterie, ale též induktorem bph
degradační dráhy u bakterií.
16.2.6 Aplikace fytoremediace
Abychom ověřili námi získané výsledky v laboratorních podmínkách, provedli jsme několik
nezávislých pokusů v reálné kontaminované půdě a to v kultivačních nádobách a na malém pokusném
políčku vymezeném na skládce kontaminované půdy. Pokusy byly prováděny jen s některými
rostlinnými druhy testovanými v laboratoři. V průběhu tří let jsme každý rok na jaře osázeli kultivační
nádoby s kontaminovanou půdou rostlinnými druhy – Solanum nigrum (lilek černý), Nicotiana
tabacum (tabák viržinský) a Medicago sativa (vojtěška setá). Lilek černý byl vybrán vzhledem k velmi
dobrým výsledkům získaným v laboratoři. Tabák je, podobně jako E.coli v mikrobiologii, jedním z
nejčastějšých modelů v biochemických a molekulárně biologických studiích u rostlin. U vojtěšky byl
předpokládán bohatý kořenový systém obsahující velká množství mikrobiálních druhů. Tabulka 16-4
uvádí výsledky získané v letech 1998, 1999 a 2000. Rostliny byly v kultivačních nádobách
kultivovány na otevřeném a všem povětrnostním vlivům vystaveném prostranství.
VII-95
Úvodní národní inventura POPs v ČR
R-T&A
Část VII - Technologie a biotechnologie
Tabulka 16-4: Obsah PCBs v kultivačních nádobách s kontaminovanou půdou osázenou různými
rostlinnými druhy
Nevegetovaná
Vojtěška
Tabák
Lilek
[µg PCBs.g-1]
[µg PCBs.g-1]
[µg PCBs.g-1]
[µg PCBs.g-1]
1998**a)
470 (100%)*
400 (85%)*
358 (76%)*
367 (78%)*
1999** b)
179 (100%)*
144 (81%)*
140 (78%)*
145 (81%)*
c)
335 (100%)*
254 (75%)*
225 (67%)*
270 (80%)*
Sezona
2000**
* čísla v závorkách uvádí výsledky residuálního obsahu PCB v % v suché půdě oproti nevegetované kontrole
** každý rok byla použita půda z jiného zdroje:
a) Lhenice - skládka kontaminované zeminy
b) Lhenice - skládka kontaminované zeminy
c) Jablonné – plocha bývalého závodu na výrobu kondenzátorů
V prvním a druhém roce byly sledovány i počty mikroorganismů v rhizosfeře a na kořenech
jednotlivých rostlinných druhů na konci kultivace při odběru vzorků pro stanovení PCBs. Celkové
počty mikroorganismů a počty zachycených bakterií rodu Pseudomonas, získané po extrakci a isolaci
bakteriálních buněk v roce 1998 uvádí tabulka 16-5.
Tabulka 16-5: Počty mikroorganismů zjištěné v půdních extraktech kontaminované půdy získaných
z rhizosfery (okolí kořenů) a kořenů po šesti měsících kultivace (rok 1998)
Rostlinný
Neveg
Vojtěška
Vojtěška
Tabák
Tabák
Lilek
Lilek
druh
půda
kořeny
rhizosfera
kořeny
rhizosfera
kořeny
rhizosfera
1x 105
1,8x 108
5,4x 105
2,9x 108
7,4x 106
6x 108
3,2x 105
2x 105
2x 107
1,2x 105
5,6x 107
6,5x 105
4,9x 107
1,6x 105
Celkový
počet MO
cfu*.g-1 půdy
Pseudomonas
cfu*.g-1 půdy
*cfu – počet jednotek tvořících kolonie
Z tabulky 16-5 vyplývá, že všechny rostlinné druhy významně podporují růst mikroorganismů, což je
viditelné hlavně u isolátů získaných přímo z kořenů rostlin. V této oblasti bylo stanoveno až o tři řády
více mikroorganismů než v nevegetované půdě. Stejný trend ukázaly i výsledky získané ve druhém
roce. Při hodnocení výsledků je nutné přihlédnout nejen k podmínkám, které jsme se snažili
každoročně dodržet, ale též k podmínkám, které nelze přímo ovlivnit, tzn. složení půdy, obsah jiných
kontaminantů kromě PCBs a také počasí.
Obdobně jako v kultivačních nádobách byly pokusy prováděny na pokusném políčku nezávisle ve
dvou letech. Na políčku upraveném na skládce kontaminované zeminy byly vysázeny malé sazeničky
tří rostlinných druhů - lilku černého, tabáku viržinského a vojtěšky seté. Každý z rostlinných druhů
včetně nevegetované kontroly byl kultivován na ploše přibližně 1m x 1,5 m po dobu 7 měsíců. I
v tomto případě byl zaznamenán pokles koncentrace PCBs oproti nevegetované půdě, hodnoty byly
srovnatelné s pokusy v kultivačních nádobách.
VII-96
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16.2.7 Závěr
Z publikovaných výsledků a z dosavadních experimentálních zkušeností vyplývá, že největší
perspektivu na praktické využití biotechnologií k odstraňování PCBs ze životního prostředí mají
technologie využívající konsorcií rostlin a bakterií a sekvenční technologie - kombinace anaerobního a
aerobního procesu.
16.3 Navržené biotechnologie k odstranění PCBs v České republice
16.3.1 Úvod
V současné době není na území ČR povolená žádná technologie využívající činnosti biologických
systémů odstraňování PCBs. V průběhu posledních 7 let byly povoleny dvě technologie jako
ověřovací studie, vázané na určitou lokalitu a s omezenou platností doby trvání. Další technologie
využívající činnosti mikroorganismů je v procesu schvalování. Mimo to byly na skládkách
kontaminované hlíny ověřeny některé výsledky získané při pokusech sledujících schopnosti rostlin
degradovat PCBs.
16.3.2 Schválené a navržené technologie
16.3.2.1 Lokalita Žamberk
V roce 1995 byl schválen SZÚ Technologický postup dekontaminace vod kontaminovaných
polychlorovanými bifenyly kombinaci sorpce a biodegradace pro lokalitu ZEZ Žamberk.
16.3.2.1.1 Princip technologického postupu
Při tomto technologickém postupu byly PCBs obsažené ve spodní vodě v první fázi sorbovány na
vhodný sorpční materiál, takto ošetřená voda byla poté dočištěna na koloně s aktivním uhlíkem a
suspenze obsahující nasorbované PCBs byla podrobena biodegradaci za přídavku směsné kultury
bakterií.
16.3.2.1.2 Popis technologického postupu
Kontaminovaná voda byla pumpována do reservoáru (3 000 l) (obrázek 16-8), a z tohoto reservoáru
(1) byla pumpována na stripovací kolonu (2), která byla naplněna polyetylénovými částicemi o
průměru 1 cm. Voda tímto postupem zbavená chlorethylénů byla přemístěna do zásobního tanku (3) a
odtud byla přečerpána do sorpčního tanku (4) o objemu 2 000 l. Jako sorpční materiál byl použit
bentonit (10 kg) aktivovaný síranem železitým a suspenze byla míchána po 2 hodiny. Kyselost vody
byla upravena na pH 7 přídavkem hydroxidu vápenatého a 50 g flokulantu Praestol 611. Sedimentace
sorbetu probíhala ve dvou nádržích 1 700 l (5). Rychlost průtoku ošetřené vody do sedimentační
nádrže byla 20-25 l.hod-1. Retenční čas vody v nádrži 130-170 min. Z vodní nádrže byla voda čerpána
přes pískový filtr a finální dočištění probíhalo na sloupci s aktivním uhlíkem s retenčním časem 2,5-5
min. Kal ze sedimentační nádrže (obsah pevných částí cca 5%) byl podroben biodegradaci za použití
5% inokula připraveného kultivací směsné kultury bakterií (Pseudomoas sp., Acinetobacter sp.)
VII-97
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
isolované s ohledem na degradaci PCBs. Po 36 dnech degradace se snížila koncentrace Deloru 103
(vztaženo na sušinu) z 8 mg.l-1 na 2 mg.l-1 (cca na 25%) a koncentrace Deloru 106 z 2 mg.l-1 na 0,6
mg.l-1 (cca na 30%); (Kaštánek a kol., Int. Biodeterioration and Biodegradation, (1995) 287 -300).
Obrázek 16-8: Schéma biodegradačního procesu. (1) zásobník kontaminované vody, (2) stripovací
kolona, (3) zásobní tank, (4) sorpční tank, (5a, 5b) sedimentační nádrže a/nebo bioremediační reaktory
(alternace), (6) pískový filtr, (7) filtr s aktivním uhlím, (8a, 8b) sorpční kolony s aktivním sorbetem.
16.3.2.2 Lokalita Všebořice
Na základě schváleného technologického postupu se v průběhu let 2000-2002 uskutečnil v areálu
skládky nebezpečných odpadů Všebořice společnosti SPOLIO, a.s. v Ústí nad Labem pilotní pokus
biologické sanace zemin obsahujících polychlorované bifenyly (PCBs) se záměrem snížit obsah PCBs
pod limit pro uložení upraveného materiálu na jednodruhovou skládku, tj. 100 µg PCBs.g-1 (Vyhláška
MŽP č. 338/97 Sb. o podrobnostech nakládání s odpady). V současné době jsou vyhodnocovány
získané výsledky.
VII-98
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16.3.2.2.1 Princip metody
Metoda je založena na tzv. „sekvenčním“ anaerobně-aerobním procesu biologické sanace zemin
obsahujících PCBs. Úvodní – anaerobní fáze procesu (doba trvání: 0 až 1 rok v závislosti na obsahu a
složení kontaminantu) zajišťuje reduktivní dehalogenaci výše substituovaných PCBs a tedy jejich
zpřístupnění pro následující mikrobiální rozklad, současně dochází k redukci toxicity PCBs.
Bakteriální proces v anaerobní fázi je podpořen přídavkem biologicky využitelného zdroje uhlíku a
FeSO4 do sanovaného materiálu. Zatímco přítomnost SO42- stimuluje růst sulfát-redukujících
organismů odpovědných za dechloraci PCBs, Fe2+ způsobuje vysrážení vznikajícího S2- ve formě
nerozpustného FeS. Tím se snižuje toxicita S2- vznikajícího při sulfát-redukujícím procesu.4
Primární zdroj uhlíku slouží jako donor elektronů v procesu reduktivní dechlorace. Biodegradační
potenciál zemin může být podpořen přídavkem kalu z ČOV.
Desorpce PCBs je v závislosti na charakteru sanovaných zemin zvýšena přídavkem vhodného
detergentu před zahájením anaerobní fáze procesu
Po dobu anaerobní fáze je dekontaminovaný materiál uspořádán ve vyšší vrstvě (např. 2 m) a překryt
nepropustnou fólií.
Pokud chemické analýzy potvrdí předpokládané snížení obsahu výšechlorovaných kongenerů
v porovnání s obsahem mono-, di- a trichlorovaných bifenylů, může být zahájena aerobní fáze
sanačního procesu. V aerobních podmínkách dochází k bakteriálnímu ataku bifenylové kostry
méněchlorovaných kongenerů za vzniku chlorbenzoových a chloralifatických kyselin a
k následujícímu rozkladu těchto meziproduktů.
Aerace je zajištěna pravidelnou kultivací a přídavky materiálu, který je obohacen o biologicky snadno
využitelný zdroj uhlíku potřebný pro navození kometabolismu PCBs.
V případě potřeby je do směsi aplikován schválený bakteriální preparát obsahující mimo jiné bakterie
rodu Pseudomonas a Acinetobacter.
Před zahájením procesu je do sanovaného materiálu dodán zdroj minerálních živin ve formě
průmyslového hnojiva obsahujícího prvky N a P. Hladina těchto makrobiogenních prvků je
kontrolována a regulována po celou dobu sanace.
Poloprovozní testy sanace zemin kontaminovaných PCBs se uskutečňují v areálu skládky
nebezpečných odpadů Všebořice (SPOLIO, a.s., Ústí nad Labem). Na zajištěné ploše jsou
v uzavřených kontejnerech sanovány 2 až 3 různé vzorky zemin o celkové hmotnosti cca 20 t a
maximální koncentraci PCBs 500 µg.g-1. Paralelně budou probíhají modelové laboratorní zkoušky
různých variant sanace v laboratoři firmy DEKONTA Kladno, a.s.
16.3.2.3 Lokalita Milovice
VŠCHT Praha spolu s firmou KAP podali návrh na Technologický postup pro snižování obsahu PCBs
v kontaminovaných zeminách kombinací anaerobní a aerobní biodegradace na lokalitě Milovice.
VII-99
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16.3.2.3.1 Princip a popis technologického procesu
Technologie je vypracována pro zeminy a kaly kontaminované PCBs v koncentracích do 500 µg.g-1
sušiny (suma obsahů kongenerů PCB-28, PCB-52, PCB-101, PCB-138, PCB-153, PCB-180).
Dekontaminace probíhá ve dvou fázích. V první, anaerobní fázi se zemina umístěná do zabezpečené
dekontaminační nádrže (kontejneru, vybetonovaného a izolovaného dekontaminačního boxu - objem
cca 9 m3 - vodonepropustného, ohraničeného vodonepropustnou izolovanou zdí o výšce 1 m,
s odtokem průsakových vod do vodonepropustné jímky, objem cca 1 m3) zkrápí vodou do 50 %
vlhkosti a obohatí minerálním hnojivem (obsahujícím N a P) do 1% vztaženo na celkové množství
dekontaminovaného materiálu. Do půdy se přidá síran železnatý (do 100 g.m-3 materiálu), vodný
roztok organického ko-substrátu (do 500 l.m-3) a/nebo organický materiál (v množství do 100 kg.m-3)
při tlouštce vrstvy do 1 m. V tomto stavu se systém udržuje po dobu 3-4 měsíců, během této doby se
podle potřeby doplňuje voda případně minerální živiny a organický ko-substrát. Organickým kosubstrátem se rozumí destilační zbytek z výroby lihovin, odpady ze zpracování celulózy, papíru a
lepenky, odpady z mlékárenského průmyslu, vše buď ve směsi a nebo jednotlivě a to do koncentrace
10-14 g.l-1 organického podílu. Organickým materiálem se rozumí kompost, sláma, piliny (odpady
z primární produkce zemědělské a zahradnické, z lesního hospodářství, z rybářství a výroby a
zpracování potravin kromě agrochemického odpadu, případně jiné odpady z potravinářského průmyslu
např. tuhé fermentační zbytky po výrobě nápojů (odpady ze zpracování ovoce, zeleniny, obilovin.
Během anaerobní fáze dekontaminace se využívá činnosti působí anaerobních bakterií a síran
železnatý funguje jako akceptor elektronů a za obvyklých fyzikálně-chemických charakteristik půd
(pH, elektrický náboj) se v půdě redukuje přímo na sulfid, který navíc pevně váže přítomné těžké kovy
a zamezuje jejich přechodu do průsakových vod.
Vrstva zeminy je v nepropustných nádržích a boxech překryta folií za účelem potlačení možnosti
kontaktu povrchu půdy se vzdušným kyslíkem, přičemž potenciálně vznikající plynné složky jako
výsledek anaerobních procesů v půdě jsou otvorem ve folii svedeny do potrubí a vedeny přes filtr.
Dvousložková náplň filtru (tuhý oxid vápenatý a piliny nasycené Fe solemi) váže reakční zplodiny
(oxid uhličitý, případně vznikající kyselé plyny a sulfan) a působí současně jako dezodorační jednotka.
Před zahájením druhé části dekontaminačního procesu se pH zeminy upraví (zvýší) přídavkem
mletého vápence a/nebo páleného vápna a/nebo hašeného vápna na hodnotu 6 až 7,5; zemina se
provzdušní převracením eventuelně přímou aerací a obohatí minerálními živinami (N a P). Poté se
aplikuje suspenze bakterií ULTRA (Pseudomonas sp. 2 a Ralstonia eutropha, 109 – 1011 buněk.ml-1)
(2,5 – 5 l.m-3 zeminy) vykazující zvýšenou schopnost odbourávat méně chlorované bifenyly. Jako
kosubstrát se použije organický odpad (kód 02 07 02 - destilační zbytek z výroby lihovin, případně
čistá sacharoza). Zemina se periodicky provzdušňuje, úbytek PCBs se sleduje v týdenních intervalech.
V případě potřeby se reaplikuje hnojivo či bakteriální preparát. Minimální teplota potřebná pro aktivní
degradaci je 15 °C. Nižší teplotu mikroorganismy přežívají ale bez znatelných biodegradačních
účinků.
Průsaky shromažďované v bezodtokové jímce se použijí ke zvlhčování zeminy, nebo se dekontaminují
postupem popsaným výše a recyklují do technologického postupu. Předpokládá se využití této
technologie v roce 2003.
VII-100
R-T&A
Úvodní národní inventura POPs v ČR
Část VII - Technologie a biotechnologie
16.3.3 Závěr
V ČR nejsou v současné době dostatečné informace a zkušenosti z aplikace bioremediačních
technologií polychlorovaných bifenylů. Perspektivní se ukazuje i možnost kombinace fyzikálních a
chemických metod s metodami biologickými.
VII-101