SPOLUPRÁCE ROSTLIN A MIKROORGANISMŮ NA ODSTRANĚNÍ

COOPERATION OF PLANTS AND BACTERIA
ON REMOVAL OF CHLOROBENZOIC ACIDS FROM CONTAMINATED SOIL
SPOLUPRÁCE ROSTLIN A MIKROORGANISMŮ
NA ODSTRANĚNÍ CHLORBENZOOVÝCH KYSELIN Z KONTAMINOVANÉ ZEMINY
Blanka Vrchotová1,2,3), Milena Dražková1), Martina Macková1,2), Tomáš Macek1,2)
1) Institute of Chemical Technology Prague, Department og biochemistry and microbiology, Technická 3,
166 28 Prague 6, Czech Republic, e-mail: [email protected]
2) Joint Laboratory of IOCB and ICT Prague, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry,
Academy of Sciences of the Czech Republic, Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic
3) ENVISAN-GEM, a.s., Dolní 2, 370 04 České Budějovice, Czech Republic
Abstract:
Chlorobenzoic acids are products of upper microbial polychlorinated biphenyls degradation pathway. Rare
occurrence of microorganisms with upper PCB degradation pathway together with degradation pathways
for chlorobenzoic acids can lead to accumulation of isomeric mixture of chlorobenzoic acids on
contaminated area. Consequence of this can be interruption or slow down of microbial degradation.
Soil was contaminated by mixture of eleven chlorobenzoic acids to concentration 5 mg/kg from each
chlorobenzoic acid. In to this soil one month old plants of black nightshade (Solanum nigrum) were
planted. Bacterial strains A18 (Pseudomonas sp.) and UH82 (Arthrobacter sp.), earlier isolated from PCB
contaminated soil, were added. After 180 days of cultivation experiment was terminated and amount of
microorganisms, concentration of chlorobenzoic acids in soil and plant biomass were determined.
The results do not prove positive impact of plants on survival of microorganisms. In soil 7 from 11 added
chlorobenzoic acids were removed under detection limit. In plant biomass just traces of chlorobenzoic
acids were detected.
Keywords:
Chlorobenzoic acid, black nightshade, microbial degradation, soil
Abstrakt:
Chlorbenzoové kyseliny jsou koncovým produktem horní mikrobiální degradační dráhy polychlorovaných
bifenylů. Vzhledem k velmi vzácnému výskytu mikroorganismů obsahujících horní PCB degradační
dráhu a zároveň i dráhy pro degradaci vznikajících chlorbenzoových kyselin může docházet k hromadění
izomerní směsi chlorbenzoových kyselin na kontaminovém území. Důsledkem tohoto jevu může být
zpomalení nebo úplné zastavení mikrobiální degradace.
Zemina byla kontaminována směsí 11 chlorbenzoových kyselin do koncentrace 5 mg/kg každé
chlorbenzoové kyseliny. Do takto připravené zeminy byly nasazeny měsíc staré rostliny lilku černého
(Solanum nigrum) a přidány mikrobiální kmeny A18 (Pseudomonas sp.) a UH82 (Arthrobacter sp.) již
dříve vyizolované ze zeminy kontaminované PCB. Po 180 dnech byl pokus ukončen a stanoveny celkové
počty mikroorganismů, koncentrace chlorbenzoových kyselin v zemině a v rostlinné biomase lilku
černého.
Z výsledků není jednoznačně patrné, že rostliny napomáhají přežití mikroorganismů. V zemině došlo
k úbytku 7 z 11 přidaných chlorbenzoových kyselin pod mez detekce. V rostlinné biomase byly
zaznamenány stopy stejných chlorbenzoových kyselin, které byly detekovány v zemině na konci pokusu.
Klíčová slova:
Chlorbenzoová kyselina, lilek černý, mikrobiální degradace, půda
Úvod
Chlorbenzoové kyseliny jsou koncovým produktem horní mikrobiální degradační dráhy polychlorovaných
bifenylů. Vzhledem k velmi vzácnému výskytu mikroorganismů obsahujících horní PCB degradační
dráhu a zároveň i dráhy pro degradaci vznikajících chlorbenzoových kyselin může docházet k hromadění
izomerní směsi chlorbenzoových kyselin na kontaminovém území (Adebusoye et al., 2008). Důsledkem
tohoto jevu může být zpomalení nebo úplné zastavení mikrobiální degradace výchozí látky. Proto je nutné
hlouběji prozkoumat možnosti degradace chlorbenzoových kyselin.
Je známo několik mikrobiálních degradačních drah chlorbenzoových kyselin. V základu se dělí na ortho-,
meta- a para- degradační dráhu podle pozice chloru v molekule chlorbenzoové kyseliny. Během
degradace dochází buď nejdříve k dehalogenaci a poté k degradaci benzenového jádra (u para- degradační
dráhy) (Scholten et al., 1991), nebo je nejdříve rozrušena struktura benzenového kruhu a teprve potom
dochází k dehalogenačnímu kroku (ortho- a meta- degradační dráha) (Hickey et al., 1990). Tyto dráhy
jsou ovlivněny ať již pozitivně či negativně přítomností dalších chlorbenzoových kyselin (Hernandez et
al., 1991). Proto je užitečné zkoumat degradační potenciál se směsí chlorbenzoových kyselin, a ne jen
s jednotlivými chlorbenzoovými kyselinami.
Rostlinný metabolismus chlorbenzoových kyselin ještě není znám přesto, že existuje mnoho publikací
potvrzujících schopnost rostlin metabolisovat chlorbenzoové kyseliny (Deavers et al., 2010; Mackova et
al., 2007). Ve většině těchto publikací se jedná o sledování metabolismu jedné chlorbenzoové kyseliny
u rostlin pěstovaných hydroponicky, či o jinak zjednodušený systém zkoumání rostlinného metabolismu.
Spolupráce rostlin a mikroorganismů může být prospěšná pro oba organismy. Rostliny mají schopnost
napomáhat přežívání mikroorganismů ve své rhizosféře tím, že zvyšují vlhkost půdy a její aeraci,
v neposlední řadě také obohacují půdu o látky, které mohou sloužit jako živiny. Naopak mikroorganismy
mohou díky svému širokému enzymatickému aparátu a rychlejšímu přizpůsobení měnícím se podmínkám
napomáhat rostlině v přežití na kontaminovaném území.
Metodika
Půda byla kontaminována směsí 11 chlorbenzoových kyselin (2-, 3-, 4-, 2,3-di, 2,4-di, 2,5-di, 2,6-di, 3,4di, 3,5-di, 2,3,5-tri a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina) do koncentrace 5 mg na kg půdy od každé
chlorbenzoové kyseliny. Do 450 g takto připravené půdy byly nasazeny měsíc a půl staré rostliny lilku
černého (Solanum nigrum), které byly buď pěstovány samotné, nebo byl do půdy přidán bakteriální kmen
A18 (Pseudomonas sp.) (Pavlů et al., 1999) či UH82 (Arthrobacter sp.) (Demnerová et al., 2003). Oba
přidané kmeny dříve prokázaly schopnost degradovat chlorbenzoové kyseliny. Jako kontrola růstu rostlin
sloužily rostliny lilku černého nasazené do půdy bez kontaminace chlorbenzoových kyselin.
Všechny možnosti byly nasazeny ve třech paralelách. Takto připravené květináče byly pěstovány při
24 °C a 16hodinové fotoperiodě po dobu 180 dní se zálivkou 150 ml týdně tak, aby nedošlo k vymývání
chlorbenzoových kyselin z půdy (protečení květináče).
Na konci pokusu byly stanoveny celkové počty mikroorganismů v půdě, koncentrace chlorbenzoových
kyselin v půdě a v rostlinné biomase lilku černého.
Půda z květináčů s rostlinou byla rozdělena na vrchní – V (do hloubky 5 cm), na půdu z oblasti kořenů
rostliny - K a na spodní půdu - S. Půda v květináčích bez rostlin byla rozdělena na vrchní a spodní. Před
stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v půdě byla půda vysušena při laboratorní teplotě,
zhomogenizována a přesáta přes síto s průměrem ok 0,1 mm. Takto připravená půda byla analyticky
navážena (4 g) a extrahována redestilovanou vodou upravenou na pH 2 přídavkem kyseliny sírové (3 ml
extrakční roztok). Extrakce probíhala 24 hodin při teplotě 28 °C a 130 RPM. Po extrakci byly vzorky
odstředěny (6 minut 10 000 x g). Před stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v supernatantu na
HPLC byly vzorky uchovávány při -18 °C. Každé stanovení bylo provedeno v 6 nezávislých měřeních od
každé ze tří paralel.
Rostlinná biomasa byla před extrakcí rozdělena na květy, plody, listy, stonky a kořeny, vysušena při
laboratorní teplotě, analyticky navážena a extrahována methanolem o HPLC čistotě. Extrakce probíhala
24 hodin při teplotě 28 °C a 130 RPM. Po extrakci byly vzorky odstředěny (6 minut 10 000 x g). Před
stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v supernatantu na HPLC byly vzorky uchovávány při 18 °C.
Stanovení chlorbenzoových kyselin na HPLC (HP 1100) bylo prováděno izokraticky na koloně Kinetex
C18 100A (150 mm x 2,1 mm x 2,6 μm) od firmy Phenomenex. Pro měření byl použit průtok mobilní fáze
0,115 ml/min o složení methanol: pufr (H3BO3 3,45 g/l; H3PO4 2,85 ml/l; CH3COOH 3,15 ml/l a NaOH 2
g/l) o pH 3,15 v objemovém poměru 45:55. Chlorbenzoové kyseliny byly detekovány při λ = 205 nm.
Výsledky
Dle výsledků celkových počtů mikroorganismů (graf 1) nelze usuzovat na pozitivní vliv rostlin na
přežívání mikroorganismů, ať už potencionálně degradujících chlorbenzoové kyseliny, či ne. Je patrné jen,
že v oblasti kořenů je množství mikroorganismů mírně zvýšené.
100
90
CFU * 107 v 1 g půdy
80
PCA
MM
PCA OD
MM OD
70
60
50
40
30
20
10
0
V
S
SNC
K
V
S
SNC MIX
K
V
S
MIX
V
S
SNC A18
K
V
S
MIX A18
V
S
SNC UH82
K
V
S
MIX UH82
Graf 1.: Celkové počty mikroorganismů v půdě po 180 dnech kultivace. PCA-plate count agar, MM
minimální médium s benzoovou kyselinou (200 mg/l), SNC – lilek černý (Solanum nigrum), MIX – půda
kontaminována směsí chlorbenzoových kyselin, A18 - Pseudomonas sp., UH82 - Arthrobacter sp., V –
vrchní půda (do hloubky 5 cm), K – půda z oblasti kořenů rostliny a S – spodní půda.
Rostliny měly pozitivní vliv na úbytek chlorbenzoových kyselin v půdě (graf 2). Dle výsledků došlo ve
všech měřených možnostech k poklesu 7 z 11 chlorbenzoových kyselin pod mez detekce. V půdě byly
detekovány jen 2,3-di, 2,6-di, 2,3,5-tri a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina. Obecně se dá říci, že
v květináčích nevegetovaných lilkem černým, je koncentrace těchto 4 chlorbenzoových kyselin vyšší než
ve vegetovaných. Nejvyšší zbytkové koncentrace byly stanoveny v případě 2,4,6-trichlorbenzoové
kyseliny, po ní následovala 2,6-dichlorbenzoová kyselina, po ní 2,3-dichlorbenzoová kyselina a nejméně
bylo 2,3,5-trichlorbenzoové kyseliny.
Zůstatek chlorbenzoových kyselin v půdě [%]
.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
246-CBA
235-CBA
35-CBA
34-CBA
26-CBA
25-CBA
24-CBA
23-CBA
4-CBA
3-CBA
2-CBA
UH82 S
UH82 V
UH82 SNC K
UH82 SNC V
UH82 SNC S
A18 V
246-CBA
A18 S
235-CBA
MIX V
MIX S
A18 SNC K
35-CBA
23-CBA
34-CBA
A18 SNC V
4-CBA
26-CBA
A18 SNC S
3-CBA
25-CBA
MIX SNC K
MIX SNC V
2-CBA
24-CBA
MIX SNC S
0
Graf 2.: Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v půdě po 180 dnech. CBA - chlorbenzoová kyselina,
SNC – lilek černý (Solanum nigrum), MIX – půda kontaminovaná směsí chlorbenzoových kyselin, A18 Pseudomonas sp., UH82 - Arthrobacter sp., V – vrchní půda (do hloubky 5 cm), K – půda z oblasti
kořenů rostliny a S – spodní půda.
Stanovení chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase (graf 3) je jen orientační vzhledem k vysokému
pozadí způsobenému velkou koncentrací látek absorbujících při 205 nm v extraktech z rostlinné biomasy
a koncentracemi chlorbenzoových kyselin v okolí meze detekce. Z tohoto důvodu byly jednotlivé
chlorbenzoové kyseliny stanoveny pouze na základě retenčního času, bez možnosti ověření pomocí
knihovny spekter. Lze říci, že tímto způsobem byly v rostlinné biomase identifikovány všechny přidané
chlorbenzoové kyseliny, až na 2,6-dichlorbenzoovou kyselinu. Nejvyšší koncentrace byly naměřeny u 2- a
2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny.
Obr. 1.: Ovlivnění vzhledu
rostliny
lilku
černého
(Solanum nigrum) růstem
v půdě s přídavkem směsi
chlorbenzoových kyselin.
Vlevo rostlina v nekontaminované půdě, vpravo rostlina v půdě s přídavkem chlorbenzoových kyselin.
140
120
Koncentrace [ug/gbiomasy]
100
80
60
40
20
246-CBA
235-CBA
35-CBA
34-CBA
26-CBA
25-CBA
24-CBA
23-CBA
4-CBA
0
35-CBA
SNC UH82 Kořen
SNC UH82 Stonek
34-CBA
SNC UH82 List
SNC UH82 Květ
SNC A18 Kořen
26-CBA
SNC A18 Stonek
SNC A18 List
25-CBA
SNC A18 Plod
SNC A18 Květ
SNC MIX Kořen
24-CBA
SNC MIX Stonek
SNC MIX List
SNC MIX Plod
23-CBA
SNC MIX Květ
SNC Kořen
SNC Stonek
4-CBA
SNC List
3-CBA
SNCPlod
SNC Květ
2-CBA
3-CBA
2-CBA
235-CBA
246-CBA
Graf 3.: Koncentrace chlorbenzoových kyselin v biomase lilku černého po 180 dnech. CBA chlorbenzoová kyselina, SNC – lilek černý (Solanum nigrum) pěstovaný v půdě bez kontaminace
chlorbenzoovými kyselinami, SNC MIX – lilek černý pěstovaný v půdě kontaminované směsí
chlorbenzoových kyselin, SNC A18 – lilek černý pěstovaný v půdě kontaminované směsí
chlorbenzoových kyselin s přídavkem kmene A18 (Pseudomonas sp.), SNC UH82 - lilek černý pěstovaný
v půdě kontaminované směsí chlorbenzoových kyselin s přídavkem kmene UH82 (Arthrobacter sp.).
Přítomnost chlorbenzoových kyselin se projevila i na vzhledu rostlin (obr. 1). Rostliny v kontaminované
půdě špatně tvořily nové listy, u stávajících listů došlo k zvětšení jejich povrchu oproti kontrole a měly
výrazně tmavší barvu. Kontaminace chlorbenzoových kyselin měla vliv i na schopnost rostlin kvést. Do
pokusu byly použity rostliny před začátkem kvetení. Rostliny v kontaminované půdě začaly kvést později
a nebyly schopné tvořit plně vyvinuté květy. Zároveň s tím tyto „nedokonalé“ květy po odkvětu opadávaly
bez vzniku plodů. Plody byly rostliny schopné tvořit až v posledním měsíci pokusu, a to tvarově jiné než
rostliny rostoucí v nekontaminované půdě. To je také důvod, proč u stanovení koncentrací
chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase chybí stanovení v plodech lilku pěstovaného s přídavkem
kmene UH82.
Diskuse
Pokus prokázal, že v půdě dochází k poměrně účinné degradaci chlorbenzoových kyselin. Během 180 dní
došlo k odstranění 7 z 11 přidaných chlorbenzoových kyselin a u zbylých 4 došlo ve většině případů
k jejich výraznému úbytku. Také dle výsledků v půdě vegetované rostlinami byl úbytek těchto
4 chlorbenzoových kyselin větší než v půdě bez přítomnosti rostlin. Vliv přídavku mikroorganismů se na
výsledcích projevil velmi málo a jednoznačně pozitivní vliv se nepodařilo prokázat. Spíše se dá
předpokládat, že za úbytek jsou zodpovědné mikroorganismy v půdě přítomné ještě před její kontaminací
směsí chlorbenzoových kyselin.
Na základě výsledků získaných měřením koncentrací chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase je
zřejmé, že nedochází k výraznému hromadění žádné z testovaných chlorbenzoových kyselin. Nejvyšší
koncentrace byly zjištěny v květech (2- a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina) a ve stoncích (2-chlorbenzoová
kyselina), u ostatních částí rostlin byla zjištěna jen stopová množství chlorbenzoových kyselin. Je možné,
že zvýšená koncentrace chlorbenzoových kyselin v květech by mohla být příčinou pozdějšího kvetení
rostlin pěstovaných v půdě s přídavkem chlorbenzoových kyselin a také špatného vývoje květů u těchto
rostlin.
Závěr
Po půl roce došlo v půdě k úbytku všech testovaných chlorbenzoových kyselin z toho u 7 pod mez
detekce. Rostliny lilku černého měly pozitivný vliv na velikost úbytku. Pozitivní vliv přidaných
mikroorganismů se nepodařilo jednoznačně prokázat.
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory grantů Centrum 1M06011, Z 40550506, MSM 6046137305 a ME 09024.
Literatura:
Adebusoye S. A., Picardal F. W., Ilori M. O., Amud O. O. 2008. Influence of chlorobenzoic acids on the
growth and degradation potentials of PCB-degrading microorganisms. World J. Microbiol. Biotechnol 24,
pp.1203-1208.
Daevers K., Macek T., Karlson U. G., Trapp S. 2010. Removal of 4-chlorobenzoic acid from spiked
hydroponic solution by willow trees (Salix viminalis). Environ Sci Pollut Res 17 pp. 1355-1361.
Demnerová K., Stiborová H., Leigh M. B., Pieper D., Pazlarová J., Brenner V., Macek T., Macková M.
2003. Bacteria degrading PCBs and CBs isolated from long-term PCB contaminated soil. Water, Air, and
Soil Pollut: Focus 3, pp. 47-55.
Hernandez B. S., Higson F. K., Kondrat R., Focht D. D. 1991. Metabolism of and inhibition by
chlorobenzoates in Pseudomonas putida P111. Appl Environ Microbiol 57/11, pp. 3361-3366.
Hickey W. J., Focht D. D. 1990. Degradation of mono-, di- and trihalogenated benzoic acids by
Pseudomonas aeruginosa JB2. Appl Environ Microbiol 56/12, pp. 3842-3850.
Macková M., Vrchotová B., Frančová K., Sylvestre M., Tomaniová M., Lovecká P., Demnerová K.,
Macek T. 2007. Biotransformation of PCBs by plants and bacteria - consequences of plant-microbe
interactions. Europ J Soil Biol 43, pp. 233-241.
Pavlů L., Vosáhlová J., Klierová H., Prouza M., Demnerová K., Brenner V. 1999. Characterization of
chlorobenzoate degraders isolated from polychlorinated biphenyl-contaminated soil and sediment in the
Czech Republic. J Appl Microbiol 87, pp. 381-386.
Scholten J. D., Chang K., Babbitt P.C.,Charest H., Sylvestre M., Donaway-Mariano D. 1991. Novel
enzymatic hydrolytic dehalogenation of chlorinated aromatic. Science 253/12, pp. 182-185.