Rok 2006

Diplomové práce absolventů studijního oboru „Kvasná chemie a bioinženýrství“,
obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha
v akademickém roce 2005/06
Zaměření Sladařství a pivovarství:
Klára Bílá: Vliv kvality sladů na průběh kvašení a vlastnosti piva (Ing. Irena Kolouchová,
Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha, Ing. Adam Brož, Budějovický Budvar, n.p., České
Budějovice)
Cílem diplomové práce na téma „Vliv kvality sladů na průběh kvašení a vlastnosti piva“ bylo
ověření významu kriterií jakosti charakterizujících jednotlivé odrůdy sladů.
Zvýšená pozornost byla věnována souvislosti mezi sledovanými parametry meziproduktů a
hotového piva a mírou rozluštění sladu. Ověřovanými slady byly slady z odrůd ječmenů
Kompakt, Scarlett a Bio slad. Formou čtvrtprovozních pokusných várek bylo připraveno
devět várek (z každého sladu tři), vedených do stadia hotového piva. Základní kvalitativní a
kvantitativní parametry, příslušející použitému sladu byly porovnávány v průběhu hlavního
kvašení a dokvašování. U ověřovaných sladů Kompakt, Scarlett a Bio byly potvrzeny rozdíly
v rychlosti úbytku extraktu a hloubce prokvašení vyplývající z charakteristiky sladů. Obsah
celkových a jednotlivých aminokyselin se výrazně nelišil a do určité míry potvrdil vyšší
proteolytické rozluštění sladu Scarlett. Větší rozdíly byly se stejnou tendencí zaznamenány
v obsahu aminodusíku.
Stanovení sacharidů a oligosacharidů ukázalo na jejich rozdílné zastoupení ve sladině,
mladině, mladém a hotovém pivu. Tendenci k vyšším hodnotám oligosacharidů vykazoval
slad z odrůdy Kompakt a Bio. Slad z odrůdy ječmene Scarlett měl vyšší podíl sacharidů
fruktosy, glukosy a maltosy.
Zvolené metody senzorické analýzy hotových výrobků určily jako pivo s nejlepším
senzorickým profilem pivo z odrůdy Scarlett, při celkovém dobrém hodnocení ostatních piv.
The influence of malt quality on fermentation process and character of final beer
The objective of this thesis – on the subject “Influence of the quality of malt on the
fermentation course and quality of beer” – was to verify the significance of the quality criteria
characterizing individual species of malt. High attention was devoted to the relation between
the analyzed parameters of the intermediate product and finished beer, and the scale of the
malt break-down. Verified malts emanated from the barley species Kompakt, Scarlett and Bio
malt.
In the form of pilot-plant experimental brews, nine brews were prepared (three from each malt
species), leading to the final beer stage. The fundamental qualitative and quantitative
parameters corresponding to the used malt were compared during the course of the
fermentation and final fermentation processes. With the verified malts Kompakt, Scarlett and
Bio differences were confirmed, in the rate of extract decrease and the depth of the
fermentation arising from the characteristics of the malt. The composition of total and
individual amino acids did not significantly differ and in some measure, confirmed the higher
proteolytic break-down of the malt Scarlett. Higher differences, with the same tendencies,
were observed in the concentration of amino nitrogens compounds.
Determination of saccharides and oligosaccharides demonstrated their different
representations in fresh malt, hopped wort, young and final beer. The tendency to higher
values of oligosaccharides was shown by the malts from Kompakt and Bio. Malt from the
barley species Scarlett had a higher portion of the saccharides fructose, glucose and maltose.
Selected methods of sensory analysis of the final products determined that the beer with the
best sensory profile was the beer from the Scarlett species, along with the overall good
evaluation of the other beers.
Dagmar Dundrová: Novel analytical methods for protein detection in barley to beer chain
(Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha, Dr. Anu Kaukovirta-Norja, VTT
Biotechnology, Finland)
Beer is a popular drink enjoyed all over the world. The choice of raw materials, water, yeast,
additives and process conditions all have an impact on beer quality.
Proteins are polymers, which are formed from different amino acids. Barley contains several
types of proteins, e.g. functional proteins like enzymes and storage proteins like hordeins.
Proteins play an important role in foam, colour, taste and colloidal stability of beer. Beer
proteins are the end product of the transformation of barley proteins in the course of different
stages of malting and brewing. In brewing science proteins have mainly been analysed with
traditional methods including total protein content, soluble nitrogen content and the amount of
free amino nitrogen. However, in order to study more deeply protein reactions during
processing more advanced methods are needed.
The aim of this work was to apply modern protein method in barley to beer chain. Proteins,
peptides and amino acids were analyzed in barley, malt and wort. For detection and analysis
of proteins were used SDS-PAGE method and two-dimensional page electrophoresis (2DPAGE). For separation and detection of peptides was used capillary electrophoresis. Amino
acids were analysed with one method.
Three fractions of hordeins (B, C, D hordeins) we obtained by SDS-PAGE electrophoresis. Bhordein was the main hordein fraction in barley and malt samples even though a large part of
hordeins seemed to be degraded during malting. The two-dimensional PAGE was used to
compare the whole protein patterns in the soluble protein fraction barley, malt and wort
samples. The lowest amount of peptides was detected in barley by capillary electrophoresis
and the highest amount of peptides was detected in malt. The major amino acid in all samples
was proline.
Nové analytické metody stanovení proteinů v technologickém řetězci od ječmene k pivu
Pivo je populární nápoj na celém světě. Výběr přírodních surovin, vody, kvasnic, přísad a
podmínek procesu, to vše má vliv na kvalitu piva.
Mezi látky, které mají vliv na kvalitu piva řadíme i proteiny. Proteiny jsou polymery, které
jsou tvořeny z různých aminokyselin. Ječmen obsahuje několik typů proteinů, např. funkční
proteiny - enzymy a zásobní proteiny - hordeiny. Proteiny hrají důležitou roli v pěnivosti,
barvě, chuti a koloidní stabilitě piva. Proteiny piva jsou konečným produktem přeměny
proteinů ječmene během technologického procesu sladování a vaření piva. V pivovarství
bývají proteiny analyzovány tradičními metodami zahrnujícími stanovení celkového obsahu
proteinů, rozpustného dusíku a volného amino dusíku. Komplexní studium reakce proteinů
během pivovarského procesu však vyžaduje dokonalejší citlivé metody.
Cílem této práce byla aplikace moderních metod stanovení proteinů v ječmeni v rámci
technologického řetězce. Proteiny, peptidy a aminokyseliny byly analyzovány v ječmeni,
sladu a mladině. Pro detekci a analýzu proteinů byly použity metody SDS-PAGE a
dvourozměrná elektroforéza (2D-PAGE). Pro separaci a detekci peptidů byla použita
kapilární elektroforéza. Aminokyseliny byly analyzovány vybranou metodou.
Tři frakce hordeinů (B, C, D hordein) jsme získali SDS-PAGE elektroforézou. B-hordein byl
hlavní frakcí ve vzorcích ječmene a sladu, přestože rozsáhlá část hordeinů byla degradována
během sladování. Dvourozměrná elektroforéza byla použita k porovnání všech vzorků
rozpustných proteinových frakcí ječmene, sladu a mladiny. Nejnižší množství peptidů bylo
detekováno v ječmeni kapilární elektroforézou a nejvyšší množství peptidů bylo stanoveno ve
sladu. Hlavní aminokyselinou ve všech vzorcích byl prolin.
Jan Dvořák: Zvýšení účinnosti degradace organických látek v bioreaktoru s recyklem
mikroorganismů (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Předložená diplomová práce se zabývá zvýšením účinnosti degradace organických látek
v bioreaktoru s recyklem mikroorganismů.
Pro všechny experimenty byla použita směsná termofilní aerobní bakteriální populace získaná
z čistírny odpadních vod. Termofilní aerobní mikroorganismy se vyznačují velmi malým
nárůstem biomasy a vysokou degradační účinností. Cílem práce bylo zjistit, zda při vyšší
koncentrací mikroorganismů lze docílit vyšší degradace organických látek. Zvýšená
koncentrace mikroorganismů byla dosažena úplným recyklem mikroorganismů.
Veškeré kultivace byly prováděny v bioreaktoru MBR–BIOREACTOR, AG, Švýcarsko. Pro
kontinuální kultivace s recyklem biomasy byla k bioreaktoru připojena membránová
separační jednotka ARNO 600 – BIO (výrobce Mikropur s.r.o, Hradec Králové). Kultivace
probíhaly při teplotě 55 0C a pH 6,5.
Glycerol v mediu simuloval odpadní vodu o vysoké hodnotě CHSK. Průběh kultivací byl
monitorován „on–line“ (koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace CO2 v odcházejících
plynech) a „off–line“ (CHSK, koncentrace glycerolu, koncentrace suché biomasy).
Vsádkové kultivace měly za cíl zjistit základní charakteristiky procesu a vlastnosti směsné
populace pro dané polosyntetické médium. Kontinuální kultivace s recyklem biomasy byly
realizovány při různých hodnotách zřeďovací rychlosti a koncentrace uhlíkatého zdroje
v médiu. Celkem byly provedeny dvě vsádkové kultivace a čtyři kontinuální kultivace s
recyklem biomasy. Pro navržené médium byl nalezeny optimální podmínky kultivace
s úplným recyklem biomasy.
Enhancement in efficiency of degradation of organic matters in bioreactor with recycle
of microorganisms
The following diploma thesis deals with enhancement in efficiency of degradation of organic
matters in bioreactor with recycle of microorganisms.
For all experiments, it was used mixed thermophilic aerobic bacterial population descending
from activated sludge from termophilic waste water treatment plant.
All the cultivations were carried out in bioreactor MBR – BIOREACTOR, AG, Switzerland.
For contiuous cultivations with recycle of microorganisms the bioreactor were coupled with
membrane separation unit ARNO 600 – BIO.
Glycerol in medium simulated sludge water with hight value of COD. The course of
cultivations was monitored on–line (DOC, concentration of CO2 in exhaust gas) and off-line
(COD (mg/l O2), concentration of the substrate, cell dry weight concentration).
Batch kultivation informed us about the behaviour of our microbial population on the medium
used. Than we carried out several continuous cultivations with recycle of microorganisms.
There were carried out two batch cultivations and four continuous cultivation with recycle of
microorganism. The best results were achieved in the third and fourth continuous cultivation
with a recycle of microorganisms.
Josef Dvořák: Elektrochemické stanovení oxidu siřičitého v pivu (Ing. Pavel Dostálek,
CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
V této diplomové práci je popsána chronopotenciometrická metoda pro stanovení celkového
oxidu siřičitého v pivu. Volné a vázané siřičitany jsou alkalizací vzorku přeměněny na
siřičitanový anion. Po okyselení roztoku je uvolněný oxid siřičitý separován přes
semipermeabilní membránu a transportován elektrolytem do měřící cely, kde je měřen
rozpouštěcí chronopotenciometrií. Navrhovaná metoda byla validována a porovnána s třemi
EBC (European Brewery Convention) metodami, 9.25.1. – Celkový oxid siřičitý v pivu:
Destilační metoda, 9.25.2 – Celkový oxid siřičitý v pivu: Enzymová metoda (archivovaná
metoda) a 9.25.3 – Celkový oxid siřičitý v pivu: p–rosanilinová metoda. Relativná směrodatná
odchylka opakovatelnosti je 8,6% pro běžnou hladinu SO2 v pivu (3,0 mg/l). Výsledky
chemického měření byly ve shodě s výsledky z porovnávaných EBC metod. Připravovaná
metoda je mnohem rychlejší a jednodušší než EBC metody.
Dalším cílem této diplomové práce bylo ověřit vliv kmene pivovarských kvasinek na tvorbu
oxidu siřičitého. Během modelových fermentací s pěti kvasničnými kmeny v laboratorních
podmínkách byla prokázána významná rozdílnost mezi testovanými kmeny. Tvorba oxidu
siřičitého během fermentace byla výrazně ovlivněna teplotou a tlakem kvašení, koncentrací
rozpuštěného kyslíku v zakvašované mladině a koncentrací mladiny. Vliv zákvasné dávky a
koncentrace síranů v mladiny byl nevýznamný.
Závěrečná část této práce je věnována monitorování obsahu oxidu siřičitého v rozdílných
značkách piv, studiu ztráty oxidu siřičitého během skladování lahvových piv a zkoumání vlivu
oxidu siřičitého na zlepšení staré chuti piva.
Electrochemical determination of sulphur dioxide in beer
A chronopotentiometric method for the determination of total sulphur dioxide in beer is
described in this diploma thesis. Free and bound sulphites are converted to sulphite anions on
alkalising the sample solutions. On acidifying the solution the released sulphur dioxide is
on-line separated through a semipermeable membrane and transported by an electrolyte into
the measuring cell and measured by stripping chronopotentiometry. The proposed method
was validated and compared with three EBC (European Brewery Convention) methods,
9.25.1. – Total Sulphur Dioxide in Beer: Distillation Method, 9.25.2 – Total Sulphur Dioxide
in Beer: Enzymatic Method (now archived) and 9.25.3 – Total Sulphur Dioxide in Beer:
p-Rosaniline Method. RSD of repeatability is 8.6% for normal SO2 level in beer (3.0 mg/L).
The results of chemical measurement correspond well with those obtained with the alternative
EBC methods. The elaborated method is much faster and simpler than the EBC methods.
The next aim of this diploma thesis was to evaluate the influence of the brewing yeast strain
on the formation of sulphur dioxide. During the model fermentations with five yeast strains
under laboratory conditions was showed a relevant difference among the tested strains. The
formation of sulphur dioxide during fermentation was significantly influenced by
fermentation temperature and fermentation pressure, concentration of dissolved oxygen in
pitching wort and concentration of pitching wort. The effect of pitching rate and concentration
of sulfates in wort was meaningless.
Last part was dedicated to study of sulphur dioxide content in different beer brands, study of
sulphur dioxide leakage during the storage of bottled beers and study of effect of sulphur
dioxide to improving of stale beer flavour.
Jakub Heřman: Obrazová analýza kvasinek (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT
Praha)
Cílem této diplomové práce bylo ověření možnosti použití metody obrazové analýzy
v oborech, ve kterých se tato metoda zatím příliš neuplatňuje. Jednalo se o sledování
kultivace obrovských kolonií kvasinek na povrchu tuhých substrátů, dále potom o submerzní
vsádkovou kultivaci kvasinek ve třepaných baňkách za různých kultivačních podmínek a
nakonec byla tato metoda použita při kontinuálních kultivacích kvasinek v laboratorním
bioreaktoru. V průběhu měření byla vypracována metoda zpracování naměřených dat.
Při kultivacích obrovských kolonií kvasinek Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa,
Saccharomyces cerevisiae a Pichia anomala na tuhých substrátech byl sledován vliv teploty.
Kolonie byly kultivovány souběžně při laboratorní teplotě a při konstantní teplotě 30°C.
Hlavními parametry k posouzení průběhu kultivace byla změna plochy kolonie v závislosti na
čase a s tím související hodinový nárůst kolonie, které umožnily určit rychlost růstu kolonie
za daných podmínek a také barevná změna ∆E.
Dalším prováděným experimentem byla submerzní vsádková kultivace ve třepaných baňkách.
Jejím cílem bylo zjistit, jak se mění morfologie a tvorba shluků kvasinek Rhodotorula
glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia anomala a Pichia pastoris v závislosti na
přítomnosti odlišných zdrojů uhlíku, v našem případě glukózy, glycerolu a methanolu.
Kontrola průběhu kultivací byla prováděna běžnými metodami, jako je vážkové určení sušiny,
počítání buněk či analýza zbytkového substrátu pomocí HPLC. Dále byly kultivace
vyhodnocovány pomocí analýzy obrazu. Byla popsána časová závislost tvorby shluků buněk a
byl vytvořen postup k identifikaci a digitální separaci objektů jiných tvarů a velikostí od
kultivovaných buněk.
Další částí této práce byla kontinuální kultivace kvasinky Pichia pastoris v bioreaktoru.
Použití metody analýzy obrazu opět doplňovalo konvenční metody sledování kultivací. Při
vyhodnocování bylo postupováno analogicky jako při kultivacích ve třepaných baňkách.
Zvláště se zde uplatnila možnost identifikace odlišných objektů, a to při zjišťování
přítomnosti jiných morfologických forem kultivovaných kvasinek, které se při těchto
pokusech vyskytovaly.
Image analysis of yeast
The aim of this diploma thesis is to verify possibilities of use of image analysis in areas where
this method is not yet used. The task was to observe cultivations of giant yeast colonies on
surface of solid substrates, submerged batch cultivations of yeasts in shaked flasks under
different conditions and finally analyzing continuous cultivations in a laboratory bioreactor.
During the measurement a method for acquired data processing was developed.
Temperature effect was observed during giant colonies cultivations with Rhodotorula glutinis,
Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae and Pichia anomala. Samples were
cultivated simultaneously at laboratory temperature and at constant temperature of 30°C.
Main parameters for description of cultivation were change of area of a colony in dependence
on time and its hour-growth. By measuring those parameters it became possible to establish
colony growth speed under given conditions as well as colour change ∆E.
Another experiment was submerged batch cultivation in shaked flasks. The aim of this
experiment was to determine how morphology and cluster occurrence change in dependence
on different carbon and energy sources, in our case glucose, glycerol and methanol. As
observed microorganisms Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia anomala
and Pichia pastoris were chosen. Cultivation control was carried out by standard methods
including cold dry weight, cell count and HPLC analysis of remaining substrate. Further on,
image analysis was also included. Time dependence of cluster formation was described and
method for identification and digital separation of objects with different shapes and sizes was
developed.
The last part of this thesis was the continuous cultivation of Pichia pastoris in a bioreactor.
Image analysis accompanied conventional methods again. Image capturing and data
evaluation was carried out similarly to cultivations in shaked flasks. Digital separation of
objects different from cultivated yeasts found its use. Those objects were named as another
morphological form of Pichia pastoris.
Petr Košin: Využití moderních metod pro kontrolu aktivity kvasnic v pivovaru (Ing. Irena
Kolouchová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha, doc. Ing. Jan Šavel, CSc., Budějovický Budvar,
n.p., České Budějovice)
Stav kvasnic nasazovaných v provozním kvašení má zásadní vliv na výslednou kvalitu
produktu, proto je jeho kontrola nedílnou součástí každodenní pivovarské praxe. Metody
používané k rutinní kontrole musejí splňovat základní požadavky jako je rychlost a
spolehlivost stanovení. V odborné literatuře lze nalézt moderní metody, které vedle těchto
požadavků nabízejí oproti klasickým metodám vyšší přesnost výsledků.
Úkolem této práce bylo ověření moderních metod kontroly kvasnic přímo v pivovarském
provoze, dále pak s využitím vybraných metod prověřit různé vlivy na kvašení a zhodnotit
stav kvasnic při hlavním kvašení a dokvašování.
Metody kontroly kvasnic se rozdělily do tří skupin na metody pro stanovení viability, testy
vitality a metody pro určení koncentrace kvasnic. U metod stanovení viability se prověřovaly
výhody fluorescenčních barviv oproti methylenové modři, u testů vitality se hledala schopnost
předpovídat průběh kvašení a pro metody stanovení koncentrace se hledala korelace s přímým
počítáním buněk.
Z ověřovaných metod stanovení viability se žádná neukázala pro rutinní využití výhodnější
než klasické barvení methylenovou modří a výsledky testů aktivity nasazovaných kvasnic
nekorelovaly s délkou provozního kvašení. Rychlé metody stanovení koncentrace kvasnic se
ukázaly jako vhodné pro provozní využití.
Application of modern methods for yeast activity control in brewery
Status of yeast used for fermentation has crucial influence on quality of the final product, and
therefore yeast control is an indivisible part of everyday brewery practice. Methods used in
routine control must meet basic requirements such as rapidity and reliability of results. There
are modern methods published in literature which next to these requirements offer better
accuracy of results, compared to the classical methods.
The task of this thesis was to verify modern methods of yeast control in a brewery, then to
employ chosen methods in a study of various influences on fermentation and in evaluation of
yeast status at primary and secondary fermentation.
Modern methods for yeast control were divided into three groups: methods for viability
assesment, vitality test and methods for biomass determination. Fluorescence stains for
viability assay were compared with the methylene blue method, vitality tests were examined
for their ability to predict fermentation performance and modern methods for biomass
determination were confronted to the cell count.
None of the modern methods for viability determination showed to bring any advantage in
routine brewery use compared to the methylene blue method, and vitality test results didn’t
correlate with duration of brewery fermentation. Rapid tests for biomass determination turned
out to be useful in daily brewery control.
Michal Kuřec: Optimalizace kontinuálního kvašení nealkoholického piva (Ing. Tomáš
Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem této diplomové práce byla optimalizace provozních podmínek kontinuálního kvašení
nealkoholického piva, zejména pak množství kyslíku dodaného do reaktoru. Vliv kyslíku na
tvorbu organolepticky aktivních látek jako vicinálních diketonů, esterů, vyšších alkoholů a
aldehydů byl sledován během kontinuálního kvašení modelového syntetického média
simulujícího složení pivovarské mladiny. Součástí práce bylo určit celkový přísun kyslíku do
reaktoru, aby mohla být tvorba výše uvedených látek vztažena na přesné množství kyslíku.
Pro určení množství vstupujícího kyslíku prostřednictvím plynu sloužícího k promíchávání
bylo nutné změřit rychlost přestupu kyslíku z plynu do kapaliny, která je charakterizována
objemovým koeficientem přestupu kyslíku kLa. Znalost hodnoty kLa nám pak umožňuje
dávkovat do reaktoru požadované a kontrolovatelné množství kyslíku. Hodnoty kLa byly
sledovány v závislosti na množství nosiče v reaktoru.
K experimentu byl použit air-lift reaktor s vnitřní cirkulací o pracovním objemu 2,9 litrů a
jako nosič pro kvasinky přečištěné mláto. Kontinuální fermentace probíhala při 8°C a při
pracovní zřeďovací rychlosti okolo 0,21 h-1. V průběhu fermentace byl měněn celkový přísun
kyslíku od 0,6 do 16,61 mgO2/l.h.
Přímý vliv kyslíku na tvorbu vicinálních diketonů nebyl potvrzen. Nicméně koncentrace
vicinálních diketonů se pohybovaly v hodnotách pod prahem vnímání. Tvorba vyšších
alkoholů se zvyšovala s růstem kyslíku, při maximální aeraci ovšem došlo k poklesu. U esterů
byl potvrzen trend jejich klesající tvorby s vyšším přísunem kyslíku. Jejich hladina však byla
celkově velmi nízká, což mělo negativní vliv na poměr vyšších alkoholů k esterům (A/E),
který pak byl vysoký. U aldehydů nebyl pozorován vliv kyslíku na rychlost jejich redukce,
tato rychlost byla ovšem plně srovnatelná s výsledky z jiných kontinuálních systémů na
výrobu nealkoholického piva.
The optimization of continuous alcohol-free beer fermentation
The purpose of this diploma thesis was to optimize the operational conditions of continuous
alcohol-free beer fermentation, especially the amount of oxygen supplied to the reactor. The
influence of oxygen on formation of flavor active compounds such as vicinal diketones,
esters, higher alcohols and aldehydes was observed during continuous fermentation of a
synthetic „model“ medium simulating the composition of brewery wort. Part of the work was
also to determine the total oxygen ingress into the reactor and express the formation of flavour
active compound as referred to oxygen supply.
In order to determine the amount of oxygen entering the reactor via driving gas it was
necessary to estimate the gas-liquid oxygen mass transfer rate characterised by volumetric
oxygen transfer coefficient (kLa). The knowledge of kLa allows us to dose and controle the
exact amount of oxygen into the reactor. The influence of solid phase (carrier) on kLa was
followed too.
An internal loop air-lift reactor with a working volume of 2.9 l was used in the experiment,
while pre-treated spent grains were used as a carrier. The continuous fermentation experiment
was carried out at 8°C and at a dilution rate around 0.21 h-1. The oxygen supply into the
reactor was changed in the range from 0.6 to 16.61 mgO2/l.h.
The positive influence of oxygen on the formation of vicinal diketones (VDK) was not
confirmed. However, the formation of VDKs was during the whole experiment below the
taste threshhold. The production of higher alcohols increased with the increasing oxygen
ingress, but decreased at the maximum aeration. Concerning esters, the expected inhibition of
their production by oxygen has been confirmed. Nevertheles, their total concentration was
low, which in turn resulted in too high fusel alcohols to esters ratio (A/E). No influence of
oxygen on aldehyde reduction was observed, although their degree of reduction was found to
be fully comparable with other systems for continuous alcohol-free beer production.
Lenka Moravcová: Fotochemická transformace resveratrolu a jeho analogů (Ing. Irena
Kolouchová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha, Ing. Juraj Harmatha, CSc., ÚOCHB AV ČR)
Fenolová látka trans-resveratrol (3,4´,5-trihydroxystilben) patří mezi hlavní antioxidanty
obsažené ve víně. Už několik let je předmětem intenzivního studia, protože vykazuje řadu
pozitivních účinků na lidské zdraví.
Předložená práce se zabývá fotochemickou transformací trans-resveratrolu, jejímiž produkty
jsou cis izomer resveratrolu a jeho dehydroderivát 3,5,7-trihydroxyfenantren, dále dimery,
trimery a další oligomery. Produkty vzniklé touto cestou měly poskytnout látky obsažené
v botrytických vínech, kde vznikají biotransformací ušlechtilou plísní Botrytis cinerea. Měly
umožnit získání těchto vzácných přírodních látek přístupnější syntetickou cestou.
Stanovení těchto látek a produktů fototransformace probíhalo metodou HPLC s UV detekcí a
metodou HPLC-MS. U některých již izolovaných látek byla provedena identifikace metodou
NMR.
Bylo zjištěno, že fototransformací dochází ke vzniku velkého množství dimerů, trimerů i
tetramerů, ale z dosavadních výsledků za našich podmínek nedochází ke vzniku látek
identických s látkami v běžných a botrytických vínech. Převážně jde o strukturní analogy
přírodních látek vhodných k dalšímu biologickému testování a k vzájemnému porovnání
jejich biologických vlastností.
Photochemic transformation of resveratrol and its analogues
The phenolic compound trans-resveratrol (3,4´, 5-trihydroxystilbene) belongs to main
antioxidants of the wine origin. It is intensively studied during recent several years, because
proving a range of positive effects on human health.
The presented work deals with photochemical transformation of trans-resveratrol, producing
its cis isomer and also its dehydro-derivative 3,5,7-trihydroxyphenantrene, as well as couple
of dimers, trimers and further oligomers. Products obtained in this way should afford
compounds readily available from botrytic wines, formed during the biotransformation caused
by the action of noble rot Botrytis cinerea. It should facilitate obtaining these rare natural
compounds by a more accessible synthetic way.
Detection and identification of the compounds and all phototransformation products was
performed by HPLC with UV detection and by the HPLC-MS method. Some of the isolated
pure compounds were identified by NMR spectrometry.
It was found, that during the phototransformation process is formed a large scale of dimmers,
trimers and also tetramers. However, according to our actual results obtained in our laboratory
conditions, there were not found identical compounds with those occurring in current or
botrytic wines. In majority, the obtained transformed substances are structural analogues of
the natural compounds suitable for further biological assays and for mutual confrontation of
their biological properties.
Jaroslav Spáčil: Optické senzory v pivovarství (Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB
VŠCHT Praha)
Standardní metody ke stanovení důležitých složek během biotechnologických výrob, včetně
výroby piva, zahrnují celou řadu metod od titračních až po chromatografické.
V dnešní době je snaha o on-line monitorování biologických procesů. Pro toto monitorování
by se dalo využít optických senzorů. Mezi jejich výhody patří rychlá odezva, malá velikost a
snadná manipulace.
Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj optických biosenzorů a možnost jejich využití
v pivovarnictví. Princip tohoto optického senzoru je založen na monitorování intenzity
fluorescence rutheniového komplexu v ORMOCERU® s imobilizovaným enzymem. Intenzita
fluorescence komplexu je zhášena kyslíkem, který využívá enzym pro oxidaci detekované
látky.
Experimentální část zahrnuje přípravu citlivé vrstvy senzoru, sledování vlivu jednotlivých
složek senzoru, vliv vnějších podmínek a měření reálných vzorků.
Obsah glukózy zjištěný off-line měřením optickým biosenzorem byl porovnán s komerčním
enzymovým testem a HPLC.
Byly provedeny testy s biosenzorem pro stanovení etanolu, ale pro optimální měření s tímto
biosenzorem je třeba dalších experimentů.
Optical sensors in brewery
Standard methods for the determination of key compounds during biotechnological processes,
including production of beer, comprise a whole range of analytical methods.
Nowadays the effort is focused on on-line monitoring of biological processes and optical
sensors seem to be a promissing alternative for this purpose. Among their advantages belongs
fast response, small size and easy manipulation.
This diploma thesis was aimed at the development of optical biosensors and their possible
application in brewing technology. The principle of the studied optical sensor is based on the
measuring the fluorescence intensity of a ruthenium complex co-immobilized with an enzyme
in an ORMOCER® . The intensity of fluorescence detected via optical fibres is quenched by
oxygen, which is competitively consumed by the enzyme during the oxidation of the
measured compound.
The experimental part covers the preparation of the sensing layers and the influence of its
composition on sensor performance, monitoring the impact of external conditions and
measurement of real samples. Glucose concentrations determined in real samples, obtained by
optical sensor measuring in off-line mode, were compared with both commercial enzyme test
and HPLC.
Tests with a biosensor for ethanol measurement were carried out as well, however, further
trials will have to be done to achieve its optimum operation.
Ondřej Staněk: Konstrukce, fermentační příprava a purifikace rekombinantních toxoidů
ACT nesoucích antigeny Mycobacterium tuberculosis (doc. Ing. Karel Melzoch, CSc.,
ÚKCHB VŠCHT Praha, Ing. Peter Šebo, Ph.D., MBÚ AV ČR Praha)
Tuberkulóza (TBC), obávané plicní onemocnění, je v současné době opět na vzestupu a to
nejen v chudých zemích třetího světa, ale i v chudinských čtvrtích průmyslových
západoevropských měst. Aktuální rozšíření TBC zdaleka nedosahuje rozměrů epidemie, ale
přesto je tento jev více než znepokojující. V dnešní době je TBC dostupně léčitelná, nicméně
před objevem antibiotik byla úmrtnost na TBC přibližně padesátiprocentní. Po zavedení léků
proti TBC ve čtyřicátých letech se úmrtnost na tuto chorobu v Evropě snížila na pouhá dvě
procenta a masové očkování tuberkulózu téměř vymýtilo.
V současné době se však ukazuje, že vedle dostatečné léčby je potřebná především včasná
diagnostika TBC. Dostupné a standardně prováděné diagnostické metody nejsou z mnoha
důvodů dostatečně spolehlivé a specifické, proto se hledají nové, účinné možnosti. Jako nová
diagnostická metoda se stále slibněji jeví presentace M. tuberculosis specifických antigenů
CFP-10 a ESAT-6 na povrchu antigen presentujících buněk (APC), které jsou přítomné
v krvi infikovaných pacientů, a indukují tak specifickou imunitní odpověď T-lymfocytů
v podobě uvolněného cytokinu interferonu-gama (IFN-γ).
Pro zlepšení této metody byl využit adenylát cyklázový toxin (ACT) bakterie Bordetella
pertusis, který je schopen dopravovat antigeny přímo do cytozolu APC, čímž se výrazně
snižuje nebezpečí nežádoucích křížových reakcí, množství přidaných antigenů pro navození
stejně účinné CD4+ i CD8+ T-buněčné odpovědi. V neposlední řaděbylo publikováno, že
použití ACT ovlivňuje lepší detekci latentní tuberkulózy.
Metodami genového inženýrství byly připraveny expresní vektory pro přípravu
rekombinantních adenylát cyklázových toxoidů nesoucích antigeny ESAT-6 nebo CFP-10 ,
které byly společně s volnými antigeny fermentovány a posléze purifikovány. Získané
proteiny byly odeslány do Kapského Města (JAR), kde budou pod vedením Prof. Roberta J.
Wilkinsona sloužit ke klinické studii diagnostiky latentní TBC.
Další část práce je zaměřena na přípravu expresních vektorů pro společnou expresi ESAT-6 a
CFP-10 antigenů, díky nimž se podařilo zčásti potvrdit tvorbu vyšších proteinových struktur,
které byly detekovány pomocí elektroforézy v nativním polyakrylamidovém gelu (BN-PAGE)
a Western blotu.
Construction, production and purification of recombinant ACT toxoids carrying
antigens of Mycobacterium tuberculosis
Tuberculosis (TB), the feared bituminosis, is nowadays on the increase again, and not only in
the poor countries of the third world, but also in slums of industrial cities in Western Europe.
By far it doesn`t reach the epidemic proportions, but this phenomenon is alarming. It seems
that TB is easy to heal and it’s not in practice a big problem to solve. Before antibiotics were
discovered, tuberculosis mortality had been approximately fifty percents. After the drugs
against tuberculosis had been established during the fortieths, tuberculosis mortality reduced
to two percent in Europe and mass vaccinations nearly exterminated this bituminosis.
Nowadays it turns out that diagnostic methods are not reliable and specific enough. That is
way new diagnostic possibilities are being searched. As a new diagnostic method is still more
hopeful presentation of antigens CFP-10 and ESAT-6 on the surface of antigen presenting
cells (APC) with specific immunity answer of T lymfocytes releasing interferon-gama (IFNγ).
For improvement of this test adenylate cyclase toxin (ACT) of bacterium Bordetella pertussis
was used, which is able to transport antigens directly into the cytozol APC, reduces amount of
antigens for test completion and stimulates as good as CD4+ and CD8+ cell response and ACT
is helpful in a detection of latent TB.
By methods of genetic engineering expression vectors with AC-toxoids carrying ESAT-6 or
CFP-10 antigen were prepared, following step was fermentation and purification all together
with free control antigens. Obtained proteins were sent to Cape Town (SAR) for the clinical
trial of TB diagnostic under the leadership of Prof. Robert J. Wilkinson.
For further study of ESAT-6 and CFP-10 interaction the expression vectors to co-express
antigens were prepared and production of higher protein structures was partly confirmed by
help of Blue Native PAGE electroforesis and/or Western blot.
Jana Šindelářová: Využití SPE a HPLC pro stanovení karbonylových sloučenin v pivu
(Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Obsah karbonylových sloučenin v pivu byl stanovován s využitím HPLC ve formě 2,4dinitrofenylhydrazonů příslušných karbonylových sloučenin. Použit byl systém HPLC
s gradientovou elucí s dvosložkovou mobilní fází acetonitrilem a vodou (rostoucí podíl
organické fáze). Látky byly detekovány pomocí detektoru diodového pole, proměřováno bylo
spektrum od 220 do 280 nm. Kvantifikace proběhla při 254 nm.
Karbonylové látky byly z piva uvolňovány buď probubláváním vzorku piva inertním plynem
(dusík) nebo destilací vzorku s vodní parou.
Vlastní 2,4-dinitrofenylhydrazony vznikly reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem buď přímo na
SPE kolonce nebo v destilátu.
Stanovovány byly následující látky: acetaldehyd, diacetyl, 2-furaldehyd, 2-methylpropanal, 2methylbutanal, 3-methylbutanal, pentanal, hexanal a E-2-nonenal.
Application of SPE and HPLC for determinantion of carbonyl compounds in beer
HPLC was used for determination of carbonylic compounds in beer as their 2,4dinitrophenylhydrazones. HPLC system used gradient elution with mobile phase, that
consisted of acetonitrile and water (ratio of organic phase was increasing during the analysis).
Carbonylic compounds were detected by photo diode array detector, measured wavelengths
were in range from 220 to 280 nm. Quantification was performed at 254 nm.
Carbonylic compounds were from beer isolated via stripping with inert gas (nitrogen) or
distillation with water vapour.
2,4-dinitrophenylhydrazones were formed on SPE cartridge or in distillate.
Following carbonylic compounds were determined: acetaldehyde, diacetyl, 2-furaldehyde,
isobutyrealdehyde, 2-methylbutanal, isovaleraldehyde, valeraldehyde, caproaldehyde, E-2nonenal.
Zaměření Kvasná chemie a technologie:
Dana Dušková: Studium kinetiky růstu kvasinky Pichia pastoris při kultivaci
v laboratorním bioreaktoru (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha)
Předmětem diplomové práce bylo sledování vlivu kultivačních podmínek na kinetické
parametry růstu kvasinky Pichia pastoris a kinetiku tvorby produktu v laboratorním
bioreaktoru za podmínek kontinuální kultivace v uspořádání chemostatu. Kultivace byly
prováděny na směsném substrátu, kde jedním ze zdrojů uhlíku a energie byl metanol. Byl
použit rekombinantní Mut+ kmen kvasinky Pichia pastoris produkující po indukci metanolem
extracelulární rekombinantní protein.
V diplomové práce byly proměřovány ustálené stavy kontinuální kultivace, kdy kultura rostla
za podmínek limitace zdrojem uhlíku a energie a kdy byly zaručeny definované podmínky
kultivace. Během ustáleného stavu dosáhly všechny měřené parametry týkající se růstu a
metabolismu ustálených hodnot. Ustáleného stavu vzhledem k tvorbě produktu se však
dosáhnout nepodařilo. Koncentrace produktu během ustáleného stavu kontinuální kultivace
klesala. Tento jev byl způsoben zřejmě degradací produktu vlivem proteolýzy a
autokatalytické degradace. Nejvyšší koncentrace produktu 121 mg.l-1 a nejvyšší specifické
rychlosti produkce 0,66 mg.gsuš-1.h-1 bylo dosaženo pro zřeďovací rychlost 0,15 h-1.
Při vyplavovacích (wash – out) experimentech byla zjištěna maximální specifická růstová
rychlost buněk na daném směsném substrátu (0,270±0,003) h-1 a maximální výtěžnost
biomasy na celkový uhlík obsažený v médiu (1,62±0,07) g.gsuš-1.h-1.
Growth kinetic study of Pichia pastoris yeast during the cultivation in the laboratory
bioreactor
The aim of this thesis was to monitor the influence of cultivation conditions on kinetic
parameters of the growth of the Pichia Pastoris yeast and on the kinetics of product formation
in a laboratory bioreactor under the conditions of continuous cultivation in the chemostat. The
cultivation was conducted on a mixed substrate containing co-substrate and methanol as the
sources of carbon and energy. The recombinant Mut+ strain of the Pichia pastoris yeast was
applied producing, after its induction by methanol, an extracellular recombinant protein.
In the first part of the thesis steady states of continuous cultivation were measured: the culture
grew while limited by a source of carbon and energy and defined cultivation conditions were
maintained. During steady states all measured parameters relating to growth and metabolism
reached steady values. However, steady states with regard to product formation were not
reached. During the steady state of continuous cultivation the concentration of the product
was declining. This was likely due to product degradation caused by proteolysis and
autocatalytic degradation. The highest product concentration 121 mg.l-1 and the highest
specific production rate 0.66 g.gCDW-1.h-1 was reached with the dilution rate being 0.15 h-1.
Due to product degradation the second part of the thesis focused on monitoring the kinetics of
product formation after the induction of the production strain by methanol during the transient
state of cultivation. By studying transient states it was discovered that the maximum specific
rate of protein production is reached after 30 to 38 hours of cultivation, a period after which
product degradation occurs.
Finally, during wash out experiments, the maximum specific cell growth rate on a given
mixed substrate was discovered (0.270±0.003) h-1 as was the maximum yield of biomass per
all carbon present in the medium (1.62±0.07) gCDW.gC-1.
Jozef Kasper: Purifikace a charakterizace nové epoxidhydrolasy z kvasinky Rhodotorula
mucilaginosa M002 (doc. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha, RNDr. Pavel
Kyslík, CSc., MBÚ AV ČR Praha)
Kvasinka Rhodotorula mucilaginosa M002 byla kultivována ve vsádkovém míchaném
bioreaktoru za použití následujících komponentů: pepton, kvasinkový extrakt, sladový extrakt
a glukosa. V průběhu kultivace byly sledovány parametry: koncentrace glukosy, koncentrace
buněk ve formě optická density a suchá hmotnost buněk, koncentrace rozpustných proteinů a
aktivita epoxidhydrolasy. Kultivace byla ukončena 19 hodin po inokulaci na základě poklesu
optické density kultury. Stanovení specifické aktivity ukázalo, že přechod kultury do
stacionární fáze je charakterizován její nejvyšší hodnotou (0,074 mU/mgsuš).
Kvůli nedostatečně vysoká hodnotě specifické aktivity stanovené při vsádkové kultivaci byla
provedena optimalizace kultivačního média metodou Plackett – Burmana. Celkově bylo
testováno dvanáct faktorů. Vliv jednotlivých faktorů na růst kultury a specifickou aktivitu byl
vyhodnocen v grafech. Nejvíce positivní vliv měl kvasinkový extrakt chlorid amonný a
pepton, faktor glukosa měla na produkci epoxidhydrolasy negativní vliv. Specifická aktivita
byla zvýšena 6,9 krát.
U dvou kmenů E. coli, TOP10 a BL21 nesoucí plastid pEPHA1, kódující epoxidhydrolásový
gen z Aspergillus niger M200 byly zkoušeny jejich aktivity. Oba kmeny byly kultivovány na
LB a minerálním médiu při 28°C. Oba kmeny na minerálním médiu dosahovali nižších
hodnot specifické aktivity. Při teplotě 37°C byly kultivovány oba kmeny jen na komplexním
médiu. Specifické aktivity byly i v tomto případě nevyhovující. Nejvyšší hodnota specifické
aktivity byla stanovena u kmenu E. coli TOP10 (pEPHA1) kultivovaného při 28°C.
Purifikace epoxidhydrolasy byla provedena srážením síranem amonným a použitím čtyřech
FPLC kolon: Phenyl – Sepharosa, Mimetic green, Mono P, Superdex 200. Maximální
dosažena specifická aktivita rekombinantní epoxidhydrolasy vztažena na bílkoviny byla
stanovena po kroku s Mimetic green a její hodnota byla 8076mU/mg. Poté specifická aktivita
klesla, enzym v čisté formě změnou iontové síly pufru částečně denaturoval. Výsledná
specifická aktivita byla nižší: 4609mU/mg.
Purification and characterization of a novel epoxide hydrolase form yeast Rhodotorula
mucilaginosa M002
The yeast Rhodotorula mucilaginosa M002 was cultivated in a batch process in bioreactor
using the following components: peptone, yeast extract, malt extract and dextrose. During
cultivation following quantities were determinated: dextrose concentration, cell concentration
(optical density and cell dry weight), soluble protein concentration and epoxide hydrolase
specific activity. The cultivation was stopped 19 hours after inoculation, when the optical
density started to decrease. At this time point the specific activity had its highest value (0,074
mU/mgcdw).
Due to low specific epoxide hydrolase activities determined in the batch cultivation the
composition of the medium was optimized using a Plackett – Burman method. Total twelve
factors were optimized. The influence of each factor on cell growth and epoxide hydrolase
activity was evaluated separately. Yeast extract, peptone and ammonia chloride had the most
positive impact, whereas glucose had the most negative influence. The specific activity was
improved 6,9 times.
Two E. coli strains, TOP10 and BL21 harboring plasmid pEPHA1, which encodes the
epoxide hydrolase gene form Aspegillus niger M200, were tested for activity. Each strain was
cultivated in shaking flakes in LB or mineral medium at 28°C. Lower specific activities were
determinated in mineral medium for both strains. At 37°C LB was used as a single medium.
Specific activities in this case were low too. The highest specific activity was determinated
with E. coli TOP10 (pEPHA1) grown at 28°C.
Purification of epoxide hydrolase was carried out by ammonium sulphate precipitation and
four FPLC columns: Phenyl – Sepharose, Mimetic green, Mono P, Superdex 200. During
purification the highest specific activity of 8076mU/mgproteins was determinated after Mimetic
Green purification step. After this purification step specific activity decreased due to enzyme
denaturation, when enzyme was conveyed from one to another transport buffer and the ion
concentration was changed. Final specific activity was determinated to be 4609 mU/mgproteins.
Veronika Najralová: Studium vlivu kultivačních podmínek na fyziologický stav kvasinky
Pichia pastoris a tvorbu produktu (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha)
Diplomová práce byla zaměřena na sledování vlivu kultivačních podmínek na fyziologický
stav rekombinantní kvasinky Pichia pastoris. Ke studiu byly použity optické metody,
konkrétně světelná a fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie.
V první části diplomové práce byl proveden screening vhodných barviv a současně byly
optimalizovány podmínky barvení. Ke sledování fyziologického stavu Pichia pastoris byla
použita fluorescenční barviva, která lze z hlediska jejich působení na buňky rozdělit do 3
skupin: barviva pro sledování membránové integrity, barviva ke studiu membránového
potenciálu a ke stanovení esterasové aktivity buněk. Ze skupiny pro studium membránové
integrity byl zkoumán propidium jodid, ethidium bromid a Sytox Green. Ze skupiny pro
studium membránového potenciálu bis-(1,3-dibutylbarbiturová kyselina) trimethin oxonol
(dále jen bis-oxonol), 3,3´-diethyloxakarbokyanin jodid (DiOC2(3)) a Rhodamin 123 a z
barviv k určení esterasové aktivity byl zkoumán fluorescein diacetát a 5(6)karboxyfluorescein diacetát. U všech barviv byla provedena optimalizace podmínek značení,
kde byly barveny jak vitální buňky, tak buňky fixované ethanolem, varem a přídavkem
metabolického rozpojovače oxidativní fosforylace karbonylkyanid-m-chlorofenylhydrazonem
(CCCP). Z těchto fluorescenčních sond byly vybrány jako nejvhodnější barviva propidium
jodid a bis-oxonol k monitorování fyziologického stavu kvasinky P.pastoris.
Ve druhé části diplomové práce byl sledován vliv podmínek kultivace na fyziologický stav
rekombinantní kvasinky Pichia pastoris produkující rekombinantní protein při kontinuální
kultivaci v laboratorním bioreaktoru. Nejprve byl sledován fyziologický stav buněk populace
v ustáleném stavu kontinuální kultivace v uspořádání chemostatu pro různé zřeďovací
rychlosti a poté byl sledován vliv různých podmínek (snížení teploty a pH) na fyziologii
Pichia pastoris. Byla též sledována fyziologická odezva populace na produkci proteinu po
indukci exprese methanolem. Bylo zjištěno, že produkce proteinu nesnižuje životaschopnost
populace kvasinky Pichia pastoris, ale na fyziologický stav buněk má negativní vliv zvyšující
se zbytková koncentrace methanolu v médiu.
The influence of cultivation conditions on the physiological state of Pichia pastoris yeast
cells and product formation
This study was focused on monitoring of cultivation conditions influence on physiological
state of recombinant yeast Pichia pastoris. Direct optical methods such as flow cytometry and
light and fluorescent microscopy were used to cell analysis.
In the first part of diploma thesis screening of suitable dyes was done and the conditions of
staining were optimized. In order to physiological characteristics observation, the cells were
stained using following fluorescent dyes: propidium iodide, ethidium bromide and Sytox
Green for monitoring of membrane integrity; bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethin oxonol
(bis-oxonol), 3,3´-diethyloxacarbocyanin iodide (DiOC2(3)) and Rhodamin 123 for membrane
potential presence assessment; fluorescein diacetate and 5(6)-carboxyfluorescein diacetate as
an esterase activity indicator. The staining conditions for particular dyes were optimised.
These assessments were done with living cell and cells fixated by ethanol, heating and
addition of carbonylcyanid-m-chlorofenylhydrazon (CCCP). CCCP is metabolic uncoupler of
oxidation phosphorylation. Propidum iodide and bis-oxonol were choosen as the most suitable
dyes for monitoring of physiological state of yeast Pichia pastoris cultivated in the laboratory
bioreactor.
In the second part of diploma thesis, it was observed the influence of cultivation conditions on
physiological state of recombinant yeast Pichia pastoris, that produces protein. The
physiological state was focused on monitoring of continuous cultivations in chemostat
arrangement. These cultivations were done for different dilution rate and than for different
cultivation conditions as decrease of temperature or pH. Also the physiological response of
population on production of protein in tranzient state was monitored after the induction of
expresion of protein by methanol. The production of protein does not decrease the viability of
population of yeast P.pastoris, but residual concentration of methanol negatively influenced
on the physiological state of cells.
Anna Šmardová: Identifikace termofilních mikroorganismů pomocí PCR (Dr. Ing. Petra
Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce byla zaměřena na aplikaci metod PCR-RFLP a RAPD pro identifikaci
bakterií ze směsí.
Prvním krokem pro zavedení těchto metod je úspěšná izolace dostatečného množství čisté
DNA z bakteriálních kultur. Při izolaci bylo vyzkoušeno celkem 5 metod, z toho 2 komerční
kity (od firmy Roche, USA a Sigma, Německo) Podle naměřených výsledků byly vybrány
právě kity jako nejvhodnější metoda pro izolaci genomické DNA a to jak z hlediska její
čistoty, tak i získaného množství. Dále bylo zjištěno, že při izolaci DNA z termofilních
bakterií je třeba buněčnou stěnu permeabilizovat pro lytické činitele. Jako nejvhodnější
způsob pro permeabilizaci byl zvolen roztok lysozymu (15 mg/ml).
U metody PCR-RFLP byla prvním krokem úspěšná amplifikace úseku kódujícího 16S rRNA.
K tomuto účelu byly použity specifické primery 160B7 a 160B4. Získané fragmenty měly
velikost 1500 bp.
Produkt PCR reakce byl dále podroben RFLP analýze za použití 4 restrikčních endonukleáz:
Alu I, Cfo I, Hae III a Taq I. Při této analýze byly vyzkoušeny různé teplotní i časové profily,
avšak ani v jednom případě nedošlo k vizualizaci výsledku. To bylo nejspíše způsobeno
nízkou koncentrací fragmentů, která se pohybovala pod detekčním limitem používaného gelu.
Při aplikaci RAPD analýzy s použitím primerů OPR13 a OPI07 se povedlo sestavit
elektroforetické profily pro všechny bakterie použité v této práci. Výsledky jsou i přes
charakter této metody víceméně porovnatelné s literárními zdroji.
Identification of thermophilic bacteria by PCR
This diploma thesis was aimed at PCR-RFLP and RAPD methods application for bacteria's
identification from mixture.
First step for implementation of these methods is to successfully isolate the sufficient quantity
of pure DNA from bacterial cultures. There were tested 5 methods of isolation and from that 2
commercial kits (from firm Roche, USA and Sigma, Germany). According to measured issues
there were chosen commercial kits like optimal methods for genomic DNA isolation both in
light of its cleanness and the acquired quantity. Further it was found out, that before DNA
isolation from the thermophilic bacteria their cell-wall is needed to be permeabilized. Then
the lytical agents can be used. As an optimal way for permeabilization it was chosen the
lysozyme solution (15 mg/ml).
Successful amplification of section encoding 16S rRNA was first step of the method PCRRFLP. There were used specific primers 160B7 and 160B4. The length of acquired fragments
was 1500 base pair.
Product of PCR reaction was further put through RFLP analyse using 4 restriction
endonucleases: Alu I, Cfo I, Hae III and Taq I. At this analyse there were checked-out
different profiles of temperature and schedules but there was no issue visualization. It was
most probably caused by low concentration of originated fragments, which moved below
detection limit of used gel.
There were successfully compiled electrophoretical profiles of all bacteria used in this work
by the RAPD analyse with using primers OPR 13 and OPI 07. Results are comparable with
literature sources in spite of the character of this work.
Zaměření Aplikovaná biologie a bioinženýrství:
Irena Doušková: Biodegradace benzinových par v biofiltru (prof. Ing. Jan Páca, DrSc.,
ÚKCHB VŠCHT Praha)
Tato práce se zabývá biodegradací par benzínu a ethanolu ze vzduchu pomocí biofiltrace.
Pokusy byly prováděny ve válcovém laboratorním biofiltru o vnitřním průměru 50 mm a
výšce lože 1500 mm. Biokatalyzátor představovaný směsnou mikrobní populací byl
imobilizován na inertním nosiči – Poraver.
Experimentální práce byla zaměřena na popis dynamického chování biofiltru při
krátkodobých zátěžích. Rovněž byl zjišťován efekt předřazení adsorbéru s granulovaným
aktivním uhlím před vstup do biofiltru, vliv doby zdržení polutantů na adsorpci a
biodegradaci a vliv přídavku ethanolu na biodegradaci benzínu.
Výsledky ukázaly, že zařazení adsorbéru je vhodné při periodických zátěžích, kdy během
poklesu vstupní koncentrace polutantů na nulu dochází k desorpci, čímž se adsorbér
regeneruje. Snížení doby zdržení mělo negativní vliv na účinnost adsorpce, zatímco
biodegradace nebyla ovlivněna. V případě bez předřazeného adsorbéru měl přídavek ethanolu
pozitivní vliv na odbourávání benzínových par. Měření simulující různé typy přerušovaného
provozu biofiltru neprokázala žádné výraznější rozdíly v celkovém odstranění polutantů.
Větší vliv na získané výsledky měl stupeň nasycení adsorbéru v okamžiku počátku
zatěžování. Z poklesu koncentrace podél výšky lože je zřejmé, že nejsnáze se odbourával
ethanol, následovaný aromatickými složkami a nejobtížněji byly degradovány alifatické
složky.
Biodegradation of gasoline vapor in biofilter
This study was focused on biodegradation of gasoline and ethanol vapours by biofiltration.
Experiments were performed in a bench-scale biofilter with the inner diameter of 50 mm and
the bed height of 1500 mm. A mixed microbial culture was used as a biocatalyst. Poraver
served as a packing material. Experiments describing dynamic characteristics of the biofilter
during short-time period loadings were carried out with just a biofilter and series of an
adsorption column following with a biofilter. Granulated activated carbon (GAC) was applied
as the adsorbent. The process was described evaluating the removal efficiency of the
individual stages. The impact of the following parameters was tested: (1) A contact time
between pollutants and the biocatalyst; (2) ethanol addition.
The results proved an advantage of the adsorber. The step loading rates were buffered by the
adsorption and the inlet pollutant concentrations were smoothed. After the end of loading, a
desorption of pollutants resulted in an increase of the adsorption capacity of GAC and
vapours were effectively degradated in the biofilter. Lowering the contact time resulted in a
drop of the adsorption efficiency but the degradation in biofilter remained unaffected. Using a
configuration without the adsorber, a presence of ethanol in vapour resulted in more efficient
gasoline degradation. A simulation of various loading manners showed no impact on the
entire process of pollutant removal. Studying the degradation efficiency along the biofilter
bed height proved the following removal rates of the individual pollutants: Ethanol
aromatic hydrocarbons aliphatic hydrocarbons.
Květoslava Horáková: Studium bakterií rodu Thermus s využitím obrazové analýzy (doc.
Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Předmětem diplomové práce bylo studium morfologických a fyziologických změn bakterií
rodu Thermus s využitím optických metod. Byly studovány mikrobiální druhy Thermus
species, Thermus ruber a Thermus aquaticus z České sbírky mikroorganizmů.
Ke studiu morfologických změn byla využita světelná mikroskopie s následnou počítačovou
analýzou obrazu. Mikroskopická pozorování byla zaznamenávána ve formě digitálních
fotografií, které byly dále zpracovány softwarem Lucia Imagine pro obrazovou analýzu. U
jednotlivých buněk byly měřeny změny délky, šířky, plochy a cirkularity v závislosti na stáří
populace a na změně teploty. Mezi nejvýznamnější morfologické změny bakterií rodu
Thermus patřilo prodlužování analyzovaných částic vlivem stoupající teploty a nárůst
plošného obsahu během exponenciální fáze růstu.
Studium fyziologických změn se opíralo o barvení buněk fluorescenčními barvivy a
následnou detekci fluorescence průtokovou cytometrií a fluorescenční mikroskopií. Byla
využita barviva, která detekují membránovou integritu, membránový potenciál a aktivitu
buněčných esteráz. Ke sledování změn integrity cytoplazmatické membrány byla aplikována
barviva propidium jodid, ethidium bromid a SYTOX. Aktivita buněčných esteráz byla
detekována fluorescein diacetátem, 5(6)-karboxyfluorescein diacetátem a kalcein
acetoxymethyl esterem. Ke studiu potenciálu na cytoplazmatických membránách buněk byl
využit rhodamin 123, 3,3`-diethyloxakarbokyanin jodid a bis-(1,3-dibutylbarburic acid)
trimethine oxonol. Dále bylo používáno barvivo SYTO k detekci všech buněk.
K nejvýznamnějším fyziologickým změnám patřil pokles zastoupení životaschopných buněk
se zvýšením teploty kultivace a při přechodu buněk do stacionární fáze růstu.
Pro jednotlivá barviva a příslušné kmeny byly nejprve zavedeny metody barvení, při kterých
byl sledován například vliv koncentrace barviva a doby inkubace na výslednou fluorescenci,
rychlost úniku barviva z buněk za čas, či byla mapována účinnost jednotlivých barviv
v různých fázích buněčného růstu.
Kultivace mikroorganizmů probíhaly 5 dnů při teplotách 50°C a 75°C v Luria-Bertani médiu.
Bylo ověřeno, že počítačová analýza obrazu a průtoková cytometrie jsou objektivní a rychlé
metody, které lze s výhodou využít pro studium morfologických a fyziologických
charakteristik v průběhu kultivací.
Study of the Thermus strain using image analysis
The subject of my diploma thesis was a morphological and physiological study of the
Thermus bacteria changes, using optical methods. The study was focused on three microbial
species Thermus ruber, Thermus aquaticus and Thermus species from Czech Collection of
Microorganisms.
The light microscopy and digital image analysis were used for study of morphological
changes. Digital pictures were processed using the LUCIA imaging system. The area, the
length, the width and the circularity were observed during the cultivation processes in
different temperature conditions. The most important morphological changes included
elongation of analysed particles owing to increasing temperature and an area growth during
exponential growth phase.
Physiological changes study was based on fluorescent staining of cells with flow cytometry
and fluorescent microscopy detection. Fluorescent dyes, able to detect cytoplasmatic
membrane integrity, presence of membrane potential and cell esterase activity, were used.
Propidium jodide, ethidium bromide and SYTOX were applied for membrane integrity
changes observation. Fluorescein diacetate, 5(6)-karboxyfluorescein diacetate and calcein
acetoxymethyl ester were used for cell esterase activity determination, Rhodamine 123, 3,3`diethyloxakarbokyanin jodid and bis-(1,3-dibutylbarburic acid) trimethine oxonol for
cytoplasmatic membrane potential study. SYTO dye was used for all cells detection. The most
important physiological changes included decreasing ratio of viable cells owing to increasing
temperature and in the begining of stational growth phase.
Dyeing methods for individual dyes and strains were optimised first. The dye concentration
and incubation time upon final fluorescence, the extent of intracellular dye leakage during
time and individual dye efficiency determination in various cell growth phases, were
observed.
Bacteria strains were cultivated for five days at 50°C and 75°C in the Luria-Bertani medium.
Bacterial growth was observed spectrophotometrically and characterized by an optical
density. Digital image analysis and flow cytometry were proven to be objective and fast
methods to study morphological and physiological changes during cell cultivation processes.
Jitka Hrdinová: Mikrobní biofilm jako nástroj v bioremediačních technologiích (doc. Ing.
Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem diplomové práce bylo sledovat schopnost bakteriálních populací degradovat anilin ve
volné formě a formě vázané na nosič. Byl sledován nárůst mikrobních populací v závislosti na
různých kultivačních podmínkách (pH, teplota, složení media), úbytek anilinu a schopnost
přirozené adheze na polyethylenový nosič.
Na základě dosažených výsledků - dobré biodegradační vlastnosti a schopnost kolonizovat
polyethylenové nosiče - byly vybrány dva kmeny A11 a Rhodococcus erythropolis, se
kterými byly dále prováděny experimenty v kolonovém systému za účelem ověřit
biodegradační aktivitu studovaných kmenů za těchto podmínek.
Microbial biofilm as a tool in bioremediation technologies
The object of this diploma thesis were studying biodegradation abilities of suspended and
immobilized bacterial populations. Also the growth was studied depending on various
cultivation conditions (pH, temperature, medium composition), decrease of aniline
concentration and natural adhesion of these microbial populations.
On the basis of obtained results (sufficient biodegradation properties and abilities to colonize
polyethylen carriers), two bacterial strains (A11 a Rhodococcus erythropolis) were chosen.
These strians were used for column experiments. Concurrently biodegradation abilities were
determined.
Tereza Hudcová: Mikrobní degradace nitrotoluenů (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB
VŠCHT Praha)
V této práci byla testována degradace 2,4-dinitrotoluenu v náplňových reaktorech v batch
uspořádání s cirkulací média s imobilizovanou mikrobiální populací Estarreja a Pardubice a
v submersních procesech. V náplňových reaktorech probíhaly testy zaměřené na studování
vlivu vstupní koncentrace, teploty, cirkulační rychlosti média, přerušení aerace a limitace
kyslíkem na degradační charakteristiky reaktoru. Po 3 měsících provozu byla v reaktorech
provedena identifikace směsné populace mikroorganismů imobilizovaných v reaktorech a
stanoven počet mikroorganismů směsné populace. V submersních procesech byl poté ověřen
degradační potenciál jednotlivých čistých kmenů, schopnosti směsné populace izolované z
reaktorů adaptovat se jednotlivě na 2-nitrotoluen a 4-nitrotoluen a následně na směs
2-nitrotoluenu, 4-nitrotoluenu a 2,4-dinitrotoluenu. Směsná populace byla schopna degradace
jednotlivých nitrotoluenů i jejich směsi. Submersních procesů bylo dále využito pro sledování
vlivu přítomnosti kosubstrátu na degradaci 2,4-dinitrotoluenu. Přídavek kosubstrátu (etanolu)
positivně ovlivnil degradaci 2,4-dinitrotoluenu. Jako biokatalyzátor v tomto případě sloužila
mikrobiální populace Pardubice, která byla vybrána na základě degradačních testů.
Imobilizované buňky v náplňových reaktorech vykazovaly výrazně vyšší degradační rychlost
i účinnost degradace ve srovnání s volnými buňkami v submerzních kultivacích.
Microbial nitrotoluene degradation
A degradation of 2,4-dinitrotoluene using mixed microbial cultures was studied. Experiments
were carried out in packed bed reactors and in submerged cultivations using a batch mode of
operations. The following parameters were tested in packed bed reactors: (1) Impact of the
inlet pollutant concentration; (2) Temperature effect; (3) Impact of a liquid circulation rate;
(4) Impact of the oxygen limitation. An evolution of the degradation process was performed
using the degradation rate and efficiency. Microbial analyses performed after 3 months of the
reactor operation comprised an isolation and identification of the strains present in biofilm.
Also the cell count was carried out. The degradation property of selected pure strains with
respect to 2,4-dinitrotoluene was tested. A mixed culture applied in the packed bed reactor
was able to degrade a mixture of 2,4-dinitrotoluene, 2-nitrotoluene and 4-nitrotoluene in
submerged cultivations. To speed up 2,4-dinitrotoluene degradation rate by free cells, ethanol
was added as a cosubstrate. The immobilized cells in packed bed reactors showed much
higher degradation rate and efficiency in comparison to the free suspended cells.
Miroslava Poláchová: Studium změn struktury cytoskeletu a tvorby stresových granulí
buněk Saccharomyces cerevisiae, exponovaných solnému stresu a huminovým kyselinám
(prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Huminové látky jsou všudypřítomné makromolekulární organické sloučeniny, které interagují
díky své molekulové struktuře téměř se všemi půdními složkami a buněčnými povrchy
mikroorganismů. Studiem interakcí huminových látek s buňkami kvasinek se sledují změny
cytoskeletu, který představuje významnou buněčnou strukturu zodpovědnou za množství
životně důležitých pochodů. Jeho hlavní složky, mikrotubuly a aktinová vlákna a ,,patches“
spolu se septiny se účastní řady základních funkcí včetně buněčného dělení, segregace
chromozomů, pohybu makromolekul, přemísťování organel a lokalizace růstu. Složky
cytoskeletu jsou citlivé na působení okolního prostředí, např. na zvýšenou iontovou sílu.
Na studium interakcí huminových látek byla vybrána kvasinka Saccharomyces cerevisiae.
Změny jsou sledovány u intragenově značených kmenů pomocí fluorescenční mikroskopie,
která představuje obrovský průlom v dosavadních mikroskopických technikách, protože je
možno sledovat procesy u živých buněk a není je již třeba fixovat, data jsou získávána in vivo.
Předmětem práce byla konstrukce kmenů se značenými aktinovými vlákny a mitochondriemi
spolu s ověřováním transformovaných kmenů, které byly vystaveny působení vlivu
huminových látek a zvýšené iontové síle.
Huminové látky ovlivňují celou řadu buněčných procesů především endocytózu, aktinovou a
mitochondriální dynamiku. Sorpcí na povrch umožňují buňkám kvasinek lépe se adaptovat na
zvýšenou iontovou sílu. Komplexnější poznatky interakcí huminových látek by se daly využít
při odstraňování polutantů nebo xenobiotik.
Study of the changes in cytoskeleton structure and stress granules formation in the
Saccharomyces cerevisiae cells exposed to salt straa and humic acids
Humic substances are ubiquitous macromolecular organic materials interaction with
almost everything soil components and cell surface of mikroorganisms. Study of interaction
humic substances with cells of yeast are monitoring the change of cytoskeleton which is
important cell structure accountable numer vitally important act. Its main structures
(microtubes, actin filaments and actin patches with septines) act basic function inclusive cell
divide, segregation chromosomes, move macromolecules, transfer organelles and localization
grow. Components of cytoskeleton are sensitive to act surrounding ( hight osmotic stress).
Yeast Saccharomyces cerevisiae was chosen for study of humic interactions. The change
are researching with fluorescence microscopy at intragenous tagging strains of yeast.
Fluorescence microscopy represents a big breach existing microscopy technology. We can
follow the process in living cells which we cann´t fixate it, we extract the information in vivo.
The object to this work is construct intragenous tagging strains with actin filaments and
mitochondies with control transformation strains which exposed humic acids and osmotic
stress.
Humic substances shape the whole scale cell action mainly endocytose, dynamics of atin
filaments and mitochondries. Sorption of humic substances onto the surface of yeasts allows
better adaptation to hight salt force. The comprehensive knowledges from interaction humic
substances will use to remove polutants and xenobiotics.
Olga Schreiberová: Charakteristika buněčného fenotypu ovlivněná
s huminovými látkami (doc. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
interakcí
Byl studován vliv huminové látky a různých růstových substrátů na prokaryotní
mikroorganismus, bakterii Rhodococcus erythropolis s důrazem na možnou schopnost
huminové látky pozitivně ovlivňovat její růst, zvláště za podmínek chemického stresu. Bylo
zkoumáno složení a vlastnosti buněčných obalů několika kmenů Rhodococcus erythropolis.
Byl zjištěn vliv přítomnosti huminových látek na růst i na vlastnosti buněčných obalů
bakterie, zvláště za stresových podmínek.
Přítomnost huminových látek vedla ke zvýšenému příjmu hydrofobních látek, permeabilita
buněčných obalů byla pro hydrofilní láteky za stejných podmínek mírně snížená.
Při analýze zastoupení mykolových kyselin v buněčných obalech bylo zjištěno, že přítomnost
huminových látek vede ke zvýšení zastoupení nasycených mykolových kyselin.
Analýza povrchových skupin buněčných obalů pomocí XPS vedla ke zjištění zásadního vlivu
růstového substrátu na složení buněčných obalů, kdy se měnil poměr peptidů a polysacharidů
obsažených v buněčné stěně. Při růstu na fenolu jako jediném zdroji uhlíku a energie byl
prokázán zvýšený obsah polysacharidů oproti růstu na glukose.
Characteristics of the cell phenotype created by interactions with humic acids
Effects of humic substances and various growth substrates on a prokaryotic microorganism,
the bacteria Rhodococcus erythropolis, were studied with emphasis on a possible ability of the
humic substances to affect favorably its growth, particularly under chemical stress conditions.
Composition and properties of the cell envelope of several strains of Rhodococcus
erythropolis were examined.
The effect of presence of humic substances was confirmed both for the growth and for the
properties of the cell envelope under chemical stress conditions.
The presence of humic substances lead to an increased uptake of hydrophobic substances, but
the permeability of the cell envelopes for hydrophilic substances was slightly attenuated.
The analysis of mycolic acid in the cell envelopes has shown that the presence of humic
substances leads to an increased occurrence of saturated mycolic acids.
The analysis of surface groups in the cell envelope using the XPS has revealed a principal
influence of the growth substrate on the composition of the cell envelopes, causing changes in
the ratio of peptides and carbohydrates contained in the cell wall. An increased amount of
phenol, as a sole supply of carbon and energy, was shown to cause increased contents of
carbohydrates when compared to the growth on glucose.
Ljuba Stehlíčková: Význam složení obalových vrstev eukaryot z hlediska jejich
schopnosti interagovat s ionty těžkých kovů (doc. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB
VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce byla zaměřena především na studium aditivní obalové vrstvy buňky –
extracelulárních polymerních látek (EPS), jejichž význam a funkce nebyly dosud u
eukaryotních mikroorganismů zcela objasněny. Jako model byla zvolena kultivace Candida
utilis na pevném kultivčním mediu, kdy dochází k tvorbě tzv. nenasyceného biofilmu. Byla
studována izolace a charakterizace EPS z hlediska jejich stavebních komponent – sacharidů,
proteinů a uronových kyselin. Dále byl studován vliv kultivačních podmínek na složení EPS,
v případě kultivace na pevné půdě bylo změny kultivačních podmínek dosaženo použitím
různých půd. Následně byla studována interakce iontů těžkých kovů (kobalt, měd, mangan a
nikl) s EPS. Zvoleny byly dva základní přístupy – kultivace na pevné půdě s obsahem iontu
kovu a experimenty prováděné ve fyziologickém roztoku, kdy byl eliminován případný rušivý
vliv složek kultivačního media. Za těchto podmínek byly studovány protektivní vlastnosti
EPS a distribuce iontů těžkých kovů mezi biologický materiál a roztok, která byla porovnána
s distribucí iontů těžkých kovů mezi buněčnou stěnu a roztok.
The importance of cell surface layers composition on their ability to interact with heavy
metals
The diploma thesis was focused on the study of the additional cell surface layer – extracellular
polymeric substances (EPS), mainly because of the lacking information on its function and
purpose at eukaryotic microorganisms. As a model for the study, cultivation of Candida utilis
on a solid culture medium was chosen, because so-called unsaturated biofilm is formed in this
case. Isolation and characterization of EPS were investigated in terms of their carbohydrate,
protein and uronic acid composition. Influence of the cultivation conditions on the EPS
composition was also examined. The various conditions were achieved using different solid
media. Following experiments were based on the interaction of heavy metal ions (cobalt,
copper, mangan, and nickel) with EPS. Two basic approaches were chosen. First, cultivation
on a solid medium containing heavy metal ions and second, using saline solution where the
influence of the medium components was eliminated. Under these conditions, EPS protective
features and distribution of heavy metal ions between biological material and solution were
studied and the distribution was further compared with the heavy metal ions distribution
between cell wall and solution.
Juraj Szőköl: Gene manipulation of phenol-degrading Rhodococcus erythropolis (prof.
RNDr. Vladimír Jirků, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Strains of Gram-positive genus Rhodococcus are known for their potential of degrading a
wide a range of substrates including many compounds considered as pollutants of
environment. Some strains are capable of utilizing toxic aromatic compounds like phenol,
toluene and naphtalene as sole sources of carbon and energy. To achieve improvement of the
degradative capabilities of these strains using gene manipulation procedures, basic genetic
techniques and tools were developed. Various genes involved in catabolism of aromatic
compounds have already been identified and isolated from R. erythropolis strains.
A phenol-degrading strain R. erythropolis CCM2595 was chosen for genetic analysis.
Complete cluster pheA2A1R containing genes pheA2, pheA1 and pheR coding for small and
large subunits of phenol hydroxylase and for AraC-type transcriptional regulator,
respectively, was cloned in the vector pSRK21 replicating in E. coli and R. erythropolis. R.
erythropolis strain carrying the plasmid pSRKPHE was shown to utilize phenol as a sole
source of carbon and energy more efficiently than the wild-type strain. The strain carrying the
plasmid pSRKcatRABC with the genes of catechol degradation showed a similarly improved
growth on phenol. To analyse transcriptional regulation of the phe genes, divergent promoters
P-pheR and P-pheA2 were separately cloned into the promoter probe vector pEPR. A clear
green fluorescence confirmed the function of the gfp reporter gene in pEPR and provided
evidence that the pheA2 promoter activity is induced by phenol.
Génové manipulace u kmene Rhodococcus erythropolis degradujícího fenol
Mnohé kmeny rodu Rhodococcus jsou známy pro svoji schopnost degradovat širokou škálu
substrátu včetně sloučenin považovaných za látky zněčisťující životní prostředí. Některé
kmeny jsou schopné využívat toxické látky jako jsou fenol, toluen a naftalen jako jediny zdroj
uhlíku a energie. Musely být vyvynuty zakladní genetické postupy a nástroje, použitelné pro
zvýšení degradačních schopností těchto kmenů. Do současnosti bylo izolováno a popsáno
několik génů ůčastnících se katabolizmu aromatických látek.
Pro další genetické studium byl vybrán kmen Rhodococcus erythropolis CCM 2595, který je
schopný degradovat fenol. Kompletní operon pheA2A1R, obsahující geny pheA2, pheA1 a
pheR kódující velkou a malou podjednotku fenolhydroxylasy a transkripční regulátor typu
AraC, byl klonován do podvojného vektoru pSRK21, který se replikuje v E. coli a R.
erythropolis. Kmen s plazmidem pSRKPHE dokázal využívat účinněji fenol jako jediný zdroj
uhlíku a energie v porovnání s divokým kmenem. Kmen nesoucí plazmid pSRKcatRABC
s geny kódující enzymy degradace katecholu prokázal podobně zlepšený růst na fenolu. Pro
analýzu transkripčních regulátorů genů, kódujících fenolhydroxylasu, byly promotory P-pheR
and P-pheA2 klonovány do promotor probe vektoru pEPR s genem gfp jako reportérovým
genem. Jasná zelená fluorescence potvrdila správnou funkci reportérového genu a poskytla
důkaz, že aktivita promotoru P-pheA2 je indukována fenolem.
Pavla Šúleková: Biodegradace chlorovaných aromátů zástupci prokaryot (doc. Ing. Jan
Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
V této práci je studován průběh biologické degradace aromatických chlorovaných uhlovodíků
pomocí bakteriálních kmenů Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida a Pseudomonas
fluorescens. Chlorované aromatické uhlovodíky (2 - chlorbenzoová kyselina, 4 chlorbenzoová kyselina, 2 - chlorfenol a 4 - chlorfenol) jsou uvedenými kmeny využívány
jako výhradní zdroj uhlíku a energie. V této souvislosti se prokázal vliv podmínek vnějšího
prostředí (teplota, pH, přítomnost dalších zdrojů uhlíku - glukosa, fenol, katechol a benzoová
kyselina) na růst a utilizaci uvedených C-zdrojů. V dalších pokusech byla prováděna
fyziologická adaptace kmenů na pevném médiu k vyšším koncentracím halogenovaných
aromátů. Nejvyšší koncentrace bylo dosaženo pro kmen Rhodococcus erythropolis, který je
schopen vyrovnaného růstu při koncentraci 250 mg/l 2-chlorfenolu a 2-chlorbenzoové
kyseliny. Tyto hodnoty pro Pseudomona putida jsou v obou případech 100 mg/l. Adaptace
Pseudomonas fluorescens nepřinesla uspokojivé výsledky. Biodegradační potenciál kmenu
Rhodococcus erythropolis by mohl mít technologické využití.
Biodegradation of chlorinated aromatic compounds by prokaryotic representatives
The biological degradation of chlorinated aromatic hydrocarbons by the Rhodococcus
erythropolis, Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens bacterial strains was studied.
Chlorinated aromatic hydrocarbons (2-chlorbenzoic acid, 4-chlorbenzoic acid, 2-chlorphenol
and 4-chlorphenol) can be used as a sole carbon and energy source by these microorganisms.
The effect of the extrinsic factors (such as temperature, pH, the presence of the second carbon
sources - glucose, phenol, catechol and benzoic acid) on the growth and utilization of these C-
sources was shown. In subsequent experiments the physiological adaptation of
microorganisms was carried out using agar plates with increasing concentrations of
halogenated aromatic compounds. The Rhodococcus erythropolis strain was able to grow at
the highest concentrations, which were 250 mg/l for 2-chlorphenol and 2-chlorbenzoic acid.
The highest values for Pseudomonas putida were in both cases 100 mg/l. No satisfactory
results were provided after adaptation of Pseudomonas fluorescens. Biodegradation ability of
the Rhodococcus erythropolis strain could be used in a technological application.
Marek Těšínký: Biodegradace ropných uhlovodíků ve vsádkových, přítokovaných a
kontinuálních systémech (Ing. Martina Siglová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem této diplomové práce byl výběr jednoho perspektivního mikroorganismu ze 4 taxonů
(Pseudomonas putida atyp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas veronii a Yarrowia
lipolytica) izolovaných z prostředí dlouhodobě kontaminovaných ropnými uhlovodíky. U
zvoleného kmene šlo dále o stanovení charakteristiky jeho reprodukční, růstové a degradační
aktivity vůči ropným uhlovodíkům modelujícím reálné znečištění ve vsádkových
přítokovaných a kontinuálních kultivačních systémech.
Výsledky první části experimentů, kde byl sledován vliv teploty, pH a koncentrace síranových
aniontů, potvrzují zařazení testovaných mikroorganismů mezi psychrotrofy, s optimální
teplotou růstu mezi 19–23°C. Experiment vlivu pH prokázal schopnost všech testovaných
mikroorganismů upravovat pH kultivačního média na preferovanou hodnotu (pH 6,7 – 6,9).
Vysokým koncentracím síranových aniontů se nejlépe přizpůsobila kvasinka Yarrowia
lipolytica.
Tato kvasinka ještě s bakterií Pseudomonas putida atyp. byla vybrána jako nejperspektivnější
mikroorganismus pro pokusy s přídavky surfaktantů. Při testování syntetických surfaktantů
Slovasol a BioCleaner v koncentracích 30, 50 a 100 mg.l-1 vykázala uspokojivou aktivitu
pouze kvasinka Y. lipolytica. Bakterie P. putida atyp. byla z dalších testů vyřazena.
Nejvýznamnější vliv přídavku surfaktantu byl zaznamenán u BioCleaneru, konkrétně při
koncentraci 50 mg.l-1. Intenzivního kontaktu buněk kvasinky Y. lipolytica s ropnou fází lze
dosáhnout mimo jiné i vazbou RU na polyesterové vlákno, které Y. lipolytica snadno osidluje.
Při porovnání systémů testovaných ve 3. části této práce (batch kultivace v laboratorním
bioreaktoru, semikontinuální a kontinuální kultivace) lze říci, že hodnoty celkových úbytků
RU leží v intervalu mezi 80-90 % RU za 14. dní kultivace. Podle dosažených výsledků jsou
tyto systémy prakticky totožné. Doporučit tedy lze vsádkovou kultivaci, pro její jednodušší
provedení a srovnatelnou hodnotu úbytku RU. Při batch kultivaci v laboratorním bioreaktoru
lze dosáhnout průměrného denního úbytku 15,68 mg RU.l-1.24h-1.
Biodegradation of oil hydrocarbons in batch, fed-batch and continous systems
The aim of this work is to select one prospective microorganism from the four taxons
(Pseudomonas putida atyp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas veronii and Yarrowia
lipolytica) obtained from environment long-term contaminated by petroleum hydrocarbons
(PH). Reproduction and degradation activity of chosen strain was determinated towards PH in
batch, semicontinual and continual cultivation systems.
First part of experiments is focused on the effects of temperature, pH and SO42- ions. The
temperature effect experiments confirmed classification of all tested microorganisms to the
psychrothrophs group (optimal temperature 19-23°C). All of these microorganisms preferred
pH between 6.7 – 6.9. High concentration of sulphate anions was tolerated only by the yeast
Yarrowia lipolytica.
This yeast and bacteria Pseudomonas putida atyp. were selected and used in the test of
synthetic surfactant influence. Two surfactants (Slovasol and BioCleaner) were tested in
concentrations 30, 50 and 100 mg.l-1. Only the yeast Yarrowia lipolytica was able to grow in
presence of synthetic surfactants. The significant positive effect was observed during addition
of 50 mg.l-1 of BioCleaner. Bacteria Pseudomonas putida atyp. was excluded from the further
experiments. The intensification of yeast cells contact with petroleum hydrocarbons is also
possible to reach after immobilization of cells and PH on a polyester fibre.
The comparation between batch, semicontinual and continual cultivation systems showed,
that the petroleum hydrocarbon loss varied between 80-90% in 14 days. In relation to
obtained results concerning the petroleum hydrocarbon loss - batch, semicontinual and
continual cultivation systems are practically the same. Batch cultivation in lab-scale
bioreactor is preferred because of simple execution and because of high petroleum
hydrocarbon loss from 80 to 90% in 14 days. The petroleum hydrocarbon loss in batch system
was able to reach 15.68 mg PH.l-1 per day.
Gabriela Tlapáková: Porovnání biodegradačního potenciálu mikrobních populací
rostoucích suspenzně a v biofilmu (Ing. Martina Siglová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
SOUHRN
Zatížení životního prostředí kontaminaty, jako jsou polyaromatické uhlovodíky a
polychlorované bifenyly a jejich štěpné produkty, je v současné době častým tématem mnoha
studií. Problém těchto kontaminantů spočívá především v jejich silné resistenci vůči okolnímu
prostředí a v jejich dlouhé životnosti.
Tato diplomová práce je zaměřena na porovnání procesu biodegradace těchto látek
prokaryotními mikroorganismy rostoucími v suspenzi nebo v biofilmu.
Bakteriální kmeny Gordonia terrae a Pseudomonas fluorescens, vybrané na základě
screeningu, byly vystaveny přítomnosti naftalenu a 2,4-dichlorbenzoové kyseliny, přičemž
oba tyto kontaminanty jim sloužily jako jediný zdroj uhlíku a energie.
-1
Odbourávání naftalenu (31 mg.l ) za pomoci kmenu Gordonia terrae probíhalo v suspenzi,
za laboratorních podmínek a nulové hladiny naftalenu bylo dosaženo zhruba za 2-3 dny.
Naproti tomu u experimentu za stejných podmínek, který probíhal v náplňové koloně resp. v
-1
biofilmu se podařilo u většiny zkoušených koncentrací (31 – 150 mg.l ) dosáhnout nulové
-1
hodnoty již za méně než 24 hodin, mimo koncentrace 500 mg.l , která byla odbourána za 24
hodin.
Dalším zkoumaným kontaminantem byla 2,4-dichlorbenzoová kyselina. Zatímco odbourávání
-1
tohoto kontaminantu kmenem Gordonia terrae v suspenzi bylo velmi pomalé, 100 mg.l výše
zmiňované sloučeniny v biofilmu náplňové kolony se po několika týdenní adaptaci podařilo
-1
snížit na hodnotu okolo 6 mg.l .
Druhý testovaný kmen Pseudomonas fluorescens se neprojevil, z hlediska odbourávání
naftalenu a 2,4-dichlorbenzoové kyseliny, jako technologicky využitelný. Tento kmen
dokázal odbourat naftalen při růstu v suspenzi za laboratorních podmínek na nulovou hodnotu
až za cca 300 hodin a utilizace 2,4-dichlorbenzoové kyseliny nebyla vůbec prokázána.
Comparison of biodegradation potential of microbial populations growing in suspension
or biofilm
Environmental influence by contaminants as polyaromatic hydrocarbons, polychlorinated
biphenyls and their by-products is currently a frequent topic of the many studies. The
problematic feature of these contaminants is especially their resistance to the surrounding
environment and their long persistence.
This thesis is focused on comparison of the biodegradation processes of these substances
growing either in suspension or in biofilm.
Two bacterial strains (Gordonia terrae and Pseudomonas fluorescens), which were chosen
based on the screening were exposed to the effect of naphthalene and 2,4 - dichlorobenzoic
acid whereas both contaminants were the sole energy and carbon sources.
-1
During the degradation of naphthalene (31 mg.l ) using the free cells of the strain Gordonia
terrae in laboratory conditions the zero concentration of naphthalene was achieved within 2-3
days. This result contrasts to the experiment under the same conditions but running in biofilm
setup where the zero concentration of naphthalene was achieved by all tested concentrations
-1
-1
(31-150 mg.l ) within less than 24 hours with the exception of concentration 500 mg.l which
was degraded in 24 hours.
2,4-dichlorobenzoic acid was the another studied contaminant. While degradation of this
contaminant by free cells of Gordonia terrae was very slow, using the biofilm setup enabled
-1
the degradation of 100 mg.l of above mentioned compound after several weeks adaptation to
-1
the level of 6 mg.l .
The second studied strain Pseudomonas fluorescens can not be considered from the point of
view of degradation of naphthalene and 2,4-dichlorobenzoic acid as the technologically
usable. This strain was able to degrade naphthalene in suspension in laboratory conditions to
the zero level within app. 300 hours and utilization of 2,4-dichlorobenzoic acid was even not
proved.
Martin Weiser: Fylogenetická analýza bakterií a mikrobních komunit odbourávajících
xenobiotika (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha, RNDr. Maria Brennerová,
CSc., MBÚ AV ČR)
Tato práce zahrnuje analýzu bakteriálních kmenů isolovaných ze znečištěného prostředí
s cílem získat obraz o rozmanitosti biodegradační komunity.
Zástupci bakterií schopných růst na minerálním médiu a lehkých kontaminantech (light
nonaqueous-phase liquid - LNAPL) jako jediném zdroji uhlíku, byli izolováni ze zamořených
půd v oblasti bývalého vojenského letiště v Čáslavi v České republice.
Hodnocení reakce bakteriální komunity na měnící se prostředí může pomoci najít vhodný
postup při bioremediaci. Nejčastějšími kontaminanty jsou látky ze skupiny BTEX (benzen,
toluen, ethylbenzen a xyleny), které jsou také ve velké míře na územích bývalých vojenských
letišť. Tyto látky byly také předmětem biodegradace isolovaných bakteriálních kmenů, které
byly v této práci analyzovány.
Byly použity molekulární metody na základě polymerázové řetězové rekace (PCR):
denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE), amplifikovaná restrikční analýza
ribosomální DNA (ARDRA), sekvence 16S rDNA genů a PCR analýza katabolických genů.
Izolace celkové DNA následovala po izolaci a kultivaci jednotlivých bakteríí.
Oblast V3 na 16S rDNA genech byla amplifikována pomocí PCR a následovala DGGE, která
tyto krátké amplikony rozdělila dle charakteristik jednotlivých 16S rDNA a vytvořila
takzvané otisky DNA (DNA fingerprints) každého isolátu. Tímto bylo získáno 18 skupin, do
kterých se rozdělilo všech 39 isolátů. Výsledky metody DGGE byly následně porovnány a do
jisté míry potvrzeny pomocí ARDRA. DGGE se ukazuje jako rychlá a spolehlivá metoda pro
genotypování isolátů ze životního prostředí.
Následovalo sekvenování genů pro 16S rDNA, z každé skupiny určené pomocí DGGE byl
vybrán jeden zástupce, takto byly kmeny anlyzovány i taxonomicky.
Všech 39 isolátů bylo testováno na přítomnost osmi známých katabolických genů, které mají
klíčovou roli v odbourávání mono-aromatických sloučenin.
Phylogenetic analysis of xenobiotic degrading bacteria and/or microbial communities
This work comprises analysis of bacterial strains isolated from polluted environment in order
to obtain information on biodegrading community diversity. Bacterial degraders with ability
to grow in mineral media supplemented with light nonaqueous-phase liquid (LNAPL) as the
only carbon source, were isolated from contaminated soil from the former military airport in
Čáslav, Czech Republic.
Assessment of the bacterial community reaction to changing environment would help to find
better bioremediation approaches. Most common and toxic contaminants are BTEX (benzene,
toluene, ethyl-benzene and xylenes) which are among the pollutants present in former military
air-bases. These were also subjected to biodegradation by the isolates analysed in this work.
Molecular biological methods covering the analysis were the polymerase chain reaction
(PCR) - based Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Amplified Ribosomal DNA
Restriction Analysis (ARDRA), 16S rDNA sequencing and catabolic gene PCR analysis.
Isolation and cultivation were subsequently followed by isolation of total genomic DNA from
each cultured bacteria. The V3 region of 16S rRNA genes was amplified by PCR and DGGE
of the resulting short amplicons was initially carried out in order to determine the specific and
simple fingerprint of each isolate. That allowed an easy distribution of all 39 isolates into 18
DGGE groups. The novel application of DGGE as a genotyping procedure was compared
with the classical ARDRA technique and verified by 16S rDNA sequencing. DGGE was
found as a fast and reliable method for genotyping of environmental isolated.
Further the selected isolates were analyzed by sequencing the 16S rDNA gene of one isolate
from each group. Thus the strains were identified in term of taxonomy.
The identified bacteria were characterized for the presence of eight known catabolic genes
with key function in degradation of mono-aromatic compounds.