KBC/BCHC

Univerzita Palackého v Olomouci
Přírodovědecká fakulta
Katedra biochemie
Laboratorní cvičení z biochemie (KBC/BCHC)
Zavedení úloh pro analýzu biologicky aktivních látek
LUCIE ČINČALOVÁ, TEREZA TICHÁ, LENKA LUHOVÁ, MAREK
PETŘIVALSKÝ
Olomouc 2015
OBSAH
Laboratorní řád
3
Bezpečnost práce v chemické laboratoři
3
První pomoc při nehodě
4
1.
Proteiny
5
1.1
Důkaz keratinu ve vlasech, rohovině a peří
5
1.2
Zjištění přítomnosti glutamátu v instantních polévkách
9
2.
Sacharidy
12
2.1
Izolace bramborového škrobu
12
2.2
Pozorování škrobových zrn pod mikroskopem
13
3.
Stanovení a důkazy vitamínů
15
3.1
Kvantitativní důkaz vitamínů
19
3.2
Ověření množství vitamínu C v ovoci, zelenině a nápojích
20
3.2.1 Důkaz vitamínu C v ovoci
23
3.2.2 Množství vitamínu C v nápojích
24
3.2.3 Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové
24
3.2.4 Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě
25
4.
Enzymy v potravinách
26
4.1
Stanovení proteasové aktivity v ovoci a zelenině
26
4.2
Katalasa v potravinách
30
5.
Nukleové kyseliny
31
5.1
Analýza a detekce DNA a RNA pomocí agarosové elektroforézy
31
6.
Testové otázky
35
LABORATORNÍ ŘÁD
1. Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem,
s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci.
2. Pro získání zápočtu je nutná 100% účast na cvičení. V případě nemoci si lze cvičení nahradit
v rámci zápočtového týdne (výjimečné situace se budou řešit individuálně, př. pobyt v nemocnici).
3. Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže
zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na
termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení.
4. Student je povinen přicházet do laboratoře včas.
5. Student musí být na praktické cvičení teoreticky připravený. Před zahájením cvičení vyučující
ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení dané úlohy, cvičení
vykoná v náhradním termínu. Maximální počet náhradních cvičení je 2.
6. Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a přezůvky.
7. Studenti pracují ve dvojicích. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu
pracovní stůl, na případné nesrovnalosti upozorní vyučujícího.
8. Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před používáním
přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou.
9. Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po
skončení cvičení předloží výsledky k ověření vedoucímu cvičení.
10. Následující cvičení dvojice studentů, řešící spolu danou úlohu, odevzdá jeden společný protokol,
který musí obsahovat: jména studentů, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip
úlohy, stručný pracovní postup, výsledky, diskusi, závěr (tabulky, grafy) a odpovědi na otázky
uvedené u každé úlohy.
11. Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo
a opláchnout jej destilovanou vodou.
12. Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu
vyučujícím.
13. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.
14. Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy.
15. Práce s jedovatými těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze v digestoři.
16. Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami
a jedovatými látkami.
17. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu a v případě
potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.
BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI
Všichni studenti musí být před zahájením cvičení seznámeni a přezkoušeni ze zákona č. 356/2003 Sb.
V chemické laboratoři může dojít k poranění při práci se sklem, při neopatrné manipulaci
s elektrickými přístroji a zejména při práci s chemikáliemi. Aby nedocházelo k poškození zdraví, je
nutné dodržovat základní zásady bezpečnosti práce:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího.
Seznámíme se s rozmístěním hasicích přístrojů a s únikovými východy z laboratoře.
V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. K jídlu a pití nikdy nepoužíváme chemické sklo.
Po skončení práce si důkladně umyjeme ruce.
Tašky a oblečení uložíme na vyhrazené místo mimo laboratoř.
Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv.
7. Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích.
8. Chemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary.
9. Nepipetujeme ústy!
10. Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným štítem,
ruce gumovými rukavicemi.
11. Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo pracovní
místo nepotřísnili chemikáliemi.
12. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem po
tyčince do vody za současného míchání a chlazení.
13. Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého
i spolupracovníků).
14. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň.
15. Zbytky jedů likvidujeme podle pokynů vyučujícího.
16. Při práci s etherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od horkých
součástí).
17. V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc.
18. Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče.
PRVNÍ POMOC PŘI NEHODĚ
1. Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme
2.
3.
4.
5.
6.
proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu
sodného (20 g/l), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g/l).
Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení
zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g/l), jedná-li se o kyselinu,
použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g/l). V každém případě je nutné vyhledat odborné
vyšetření u očního lékaře.
Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně neutralizaci
výplachem kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem sodným (poleptání
kyselinou).
Při požití
 louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5-2,0 g/l),
 kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě,
 jedů je charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít aspoň
0,5 l vody a vyvolat zvracení,
 chemikálií je nutné vyhledat odborné lékařské ošetření.
V případě vzplanutí hořlavých látek okamžitě vypneme elektrický proud a odstraníme všechny
hořlavé látky z blízkosti požáru. Hořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci
větších plamenů použijeme hasicí přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo
mastí na spáleniny a zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař.
Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem vodíku
(0,9 mol/l) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař.
1. Proteiny
1.1 Důkaz keratinu ve vlasech, rohovině a peří
Teoretický úvod
Keratin je klíčovou stavební bílkovinou, která představuje základní složku vlasů, chlupů a vytváří se
z něj také nehty či peří. Název keratin je odvozen řeckého keras (κέρας) znamenajícího roh či
rohovinu. Patří mezi nejhojnější proteiny v epiteliální tkáni a v buňkách tvoří tzv. intermediární
filamenta, která se podílejí na vzniku buněčné kostry (cytoskeletu). V pokožce se keratin nachází
zejména v keratinocytech tvořících až 95 % všech buněk lidské pokožky. Vznik keratinu v buňkách
a vznik různých (hlavně kožních) struktur bohatých na keratin se nazývá keratinizace čili rohovatění.
Mrtvé plně keratinizované buňky tvoří tzv. stratum corneum neboli rohovou vrstvu o tloušťce 0,01 až
0,04 mm sloužící jako vlastní kožní bariéra chránící tělo před infekcí. Pokud je tato vrstva zničena,
člověk do 24 hodin umírá na následky ztráty tekutin.
Keratin má vláknitou strukturu, řadíme ho tedy mezi skleroproteiny. Jednotlivé monomery
mívají délku 400–644 aminokyselin, ale větví se do polymerů o velkých rozměrech. Obsahuje zejména
sirné aminokyseliny, cystein a methionin. Celkový obsah síry v keratinu bývá v rozmezí od 2 do 5 % na
sušinu. Konečný tvar molekuly, terciární strukturu, zajišťují příčné disulfidické můstky. Tím jsou
vysvětleny jeho dvě nejdůležitější biologické vlastnosti, nerozpustnost a pevnost v ohybu. Při rovnání
vlasů teplem se právě tato přirozená struktura ztrácí a ničí se disulfidické můstky. Keratin je rovněž
odolný vůči působení proteolytických enzymů. Struktura keratinových útvarů je charakterizována
fibrilární částí a podílem základní amorfní látky, tzv. matrixu. Matrix vyplňuje prostor mezi
vřetenovitými buňkami a je intramolekulárně zesíťován cystinem. Jednou z hlavních skupin keratinů
jsou α-keratiny, které jsou tvořeny pravotočivým polypeptidovým řetězcem s α-helikální strukturou
(Obrázek 2). Jejich relativní molekulová hmotnost dosahuje až 50 000 kDa. Vřetenovité buňky
keratinového vlákna se skládají z mikrofibril, které se spojují do makrofibril (průměr 200 nm)
(Obrázek 1). Mikrofibrily se dále skládají z protofibril (průměr 2 nm), které tvoří peptidickými řetězci
α-struktury. Devět protofibril je uspořádáno v kruhu po obvodě mikrofibrily a dvě tvoří jádro tohoto
útvaru. Tento strukturní motiv 9+2 se často vyskytuje v bičících, které používá eukaryotní buňka při
svém pohybu. Protažením keratinového vlákna (ve vlhkém stavu až o 100%) dochází k přestavbě
α-struktury na zřasenou β-strukturu (struktura skládaného listu) s paralelním uspořádáním
(o průměru 4 nm). Tuto změnu α-struktury na zřasenou β-strukturu lze pozorovat pomocí rentgenové
difrakce.
Chemická struktura keratinu umožňuje řadu reakčních možností díky přítomností
aminokyselinových zbytků. Na reaktivitu keratinu má kromě funkčních skupin bílkovin významný vliv
přítomnost disulfidické kovalentní vazby. Dále je reaktivita keratinu podmíněná přítomností cystinu.
Keratiny bobtnají ve vodě. Vlna se při bobtnání prodlouží asi o 1,2 % a její tloušťka se zvětší asi
o 11 %. Bobtnání lze vysvětlit částečným narušením elektrovalentních (iontových) a vodíkových vazeb
a vnikáním vody do uvolněné fibrilární struktury. Absorbce vody závisí na přítomnosti hydrofilních
skupin v keratinu, ke kterým přísluší především skupiny -NH2, -COOH, -OH a peptidové skupiny.
Absorpce vody hraje důležitou roli ve fyzikálních vlastnostech keratinu.
Keratin je poměrně odolný vůči působení kyselin, což je způsobeno odolností disulfidické vazby
vůči kyselé hydrolýze. Reakcí s kyselinami je potlačena disociace -COOH skupiny, které jsou
v porovnání s bazickými skupinami vždy v nadbytku. Keratin má izolelektrický bod při pH 3,67
a s přídavkem dalšího množství kyselin získá kladný náboj. Až při delším varu a vyšších koncentracích
minerálních kyselin nastává hydrolýza bez porušení cystinu. Totální hydrolýza keratinu nastává při
zahřívání s 30% kyselinou sírovou nebo 6N kyselinou chlorovodíkovou při 110°C po dobu 24 hodin.
Působení zásad na keratin je výraznější a je funkcí pH, teploty a doby. V alkalickém prostředí se
potlačí disociace –NH3+ skupin a keratin získává negativní náboj. Disulfidická vazba cystinu podléhá
hydrolytickému štěpení. Na disulfidickou vazbu keratinu působí oxidačně bez štěpení roztok peroxidu
vodíku, roztok manganistanu draselného a fotooxidace při stárnutí keratinových bílkovin.
Keratiny se rozdělují na dva typy:


keratiny I. typu – menší, kyselé (K9–K23, Ha1–Ha8, Irs1-4),
keratiny II. typu – větší, neutrální nebo zásadité (K1–K8, Hb1–Hb6, K6irs1–4).
Keratinové odpady tvoří značnou část odpadů masného a koželužského průmyslu, zejména
srst, štětiny, kopyta, peří. Zužitkovává se pouze malé množství těchto odpadů především jako péřová
moučka nebo zpěňovací přísada do hasicích přístrojů. Jedním ze způsobů zpracovávání keratinových
odpadů je výroba keratinových hydrolyzátů či keratinových filmů. V kosmetickém průmyslu se
používá tzv. hydrolyzovaný keratin. V kosmetickém průmyslu se získaná jemně žlutá tekutina používá
v šampónech, maskách, kondicionérech, produktech pro konečnou úpravu a v celé řadě produktů pro
péči o pleť. Hydrolyzovaný keratin má hydratační, zjemňující a vyhlazující účinky. Ve vlasové
kosmetice se přidává ke snížení statické elektřiny odstraněním povrchového elektrického náboje
z vlasů. Keratinové hydrolyzáty se z velké části využívají jako zdroj proteinu při výživě dobytka pro
svůj vysoký obsah proteinů. Dále pro přípravu obalových materiálů pro mikrokapsule. Enkapsulují se
barviva, léčiva, vůně, oleje a tuky. Výhodou je zachování aktivity dané substance a regulace jejího
uvolňování na specifickém místě. Keratinové hydrolyzáty se rovněž využívají pro úpravu lýka, kdy
zvyšují jeho pevnost. Dále se také využívají v zemědělství pro výrobu hnojiv a díky vysokému obsahu
aminokyselin slouží jako stimulátory růstu.
Obrázek 1. Uložení keratinu ve struktuře lidského vlasu (převzato z https://peerj.com/articles/619/).
Obrázek 2. Struktura α-keratinu s intermolekulárními vodíkovými vazbami, které zajišťují jeho
pevnost (převzato z itech.dickinson.edu).
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: zkumavky, kádinka, stojan na zkumavky, držák na zkumavky, lihový kahan,
Pasteurova pipeta, laboratorní váhy.
Chemikálie a materiál: vlasy, peří, kůže, rohovina, 1% roztok CuSO4.5H2O (molární hmotnost 249,68
g/mol), 10% roztok NaOH (molární hmotnost 39,99 g/mol).
Pracovní postup
Chomáček vlasů, peří nebo několik kousků rohoviny ve zkumavce povaříme s 5 ml roztoku 10%
hydroxidu sodného (NaOH). Po vychladnutí přidáme po kapkách roztok 1% síranu měďnatého
(CuSO4). Pozorujte barevnou změnu.
Obrázek 3. Důkaz keratinu ve vlasech. (A) Chomáček vlasů v roztoku 10% NaOH. (B) Zahřívání vlasů
nad kahanem. (C) Vlasy se povařením v 10% NaOH rozpustily. (D) Přidáním pár kapek 1% CuSO4
vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení jako důkaz keratinu.
Obrázek 4. Důkaz keratinu v rohovině. (A) Pár kousků rohoviny v roztoku 10% NaOH. (B) Zahřívání
rohoviny nad kahanem. (C) Povařením rohoviny v 10% NaOH roztok zežloutnul. (D) Přidáním pár
kapek 1% CuSO4 vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení jako důkaz keratinu.
Obrázek 5. Důkaz keratinu v peří. (A) Pírko peří v roztoku 10% NaOH. (B) Povařením peří v 10% NaOH
roztok zežloutnul. (D) Přidáním pár kapek 1% CuSO4 vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení
jako důkaz keratinu.
Vyhodnocení
Přítomnost keratinu (bílkoviny) ve vlasech, rohovině či peří (Obrázek 3, 4, 5) dokazuje vznik
modrofialového až červenofialového zbarvení. Měďnaté ionty v alkalickém prostředí NaOH vytvářejí
s peptidovou vazbou fialové komplexní sloučeniny.
1.2 Zjištění přítomnosti glutamátu v instantních polévkách
Teoretický úvod
Kyselina L-glutamová (systematický název: kyselina (2S)-2-aminopentandiová, racionální název:
kyselina L-2-aminoglutarová) je glukogenní neesenciální aminokyselina. Vzhledem k přítomnosti dvou
karboxylových skupin v molekule vykazuje kyselina L-glutamová slabě kyselou reakci; proto se řadí ke
kyselým aminokyselinám společně s kyselinou L-asparagovou. Protože má v molekule jedno chirální
centrum, uhlíkový atom, k němuž je připojena karboxylová a aminová skupina, existuje kyselina
glutamová ve dvou stereoizomerech, jako kyselina L-glutamová a kyselina D-glutamová, které mají
stejné fyzikální vlastnosti s výjimkou optické aktivity. Živé organismy však většinou vytváří pouze
bílkoviny obsahující L-formu. Glutamát (glutaman) je sůl odvozená od kyseliny L-glutamové a je běžně
vázaná ve všech bílkovinách. Obě tyto látky tvoří bezbarvé krystaly nebo bílý prášek. Kyselinu
L-glutamovou najdeme v lidském těle i ve volné formě, například svaly obsahují přibližně 6 000 mg,
mozek 2 250 mg, ledviny 680 mg, játra 670 mg, krevní plasma 40 mg volné kyseliny glutamové.
Celkově se tedy v lidském organismu vyskytuje zhruba 10 g volné kyseliny L-glutamové. V potravinách
denně přijímáme zhruba 10 – 20 g kyseliny L-glutamové vázané v bílkovinách a 1 – 3 g ve volné
formě. Bílkoviny jsou štěpeny na jednotlivé aminokyseliny, což představuje další vstup kyseliny
L-glutamové do organismu, avšak pouze okolo 4 % volné či vázané kyseliny L-glutamové je vstřebáno.
Vzhledem k tomu, že se jedná o neesenciální aminokyselinu, lidské tělo vyprodukuje zhruba 48 g
vlastními biosyntetickými procesy nad rámec pocházející z potravinových zdrojů. Podobě jako
v lidském organismu i v říši rostlin a živočichů se vyskytuje volný glutaman. Obsah glutamanu se
v různých druzích masa pohybuje okolo 20 – 40 mg/100 g. Například hrášek a rajčata obsahují o řád
vyšší hladinu 200 mg/100 g a 140 mg/100 g. Houby obsahují 180 mg/100 g. Jedna z nejvyšších hodnot
přirozeně se vyskytujících v potravinách je 1200 mg/100 g v sýru parmezán. Největší biologický
význam má samotná kyselina L-glutamová, která se vyskytuje v centrální nervové soustavě a v sítnici
obratlovců. Funguje zde jako excitační neurotransmiter podobně jako noradrenalin, acetylcholin či
γ-aminomáselná kyselina. Zprostředkovává až 75 % všech excitací. Výkyvy hladiny mohou způsobovat
problémy od přechodných stavů (bolest hlavy, břicha, křeče, zvýšení tepové frekvence) až po
dlouhodobější (poruchy mozku a sítnice).
V potravinářském průmyslu jsou kyselina L-glutamová a její sodná sůl označovány kódem E620
a E621. Obě se používají jako dochucovadla – látky zvýrazňující chuť a vůni, a jako antioxidanty.
Z historického pohledu sahá konzumace potravin se zvýšenou hladinou glutamátu daleko do
minulosti, a to aniž by se o existence této látky vědělo. Jedná se o omáčku připravenou z nakládaných
ryb s více než 2 500letou tradicí v oblasti Středomoří. V roce 1908 byl glutaman sodný izolován z řasy
rodu Laminaria japonica profesorem Kikunae Ikedou z Tokijské university. Tato řasa se v Japonsku
využívala běžně po staletí. První průmyslové použití glutamátu na světě bylo popsáno v roce 1909.
V dnešní době se přírodně identická L-forma průmyslově vyrábí hydrolytickým štěpením rostlinných
bílkovin (sója) nebo fermentací bramborového či obilného škrobu nebo z melasy. Sodná sůl kyseliny
L-glutamové, neboli E621, bývá také označována rovněž pod zkratkou MSG (angl. monosodium
glutamate). Vyskytuje se jako bílá krystalická látka bez vůně, s charakteristickou masovou chutí. Pro
tuto další chuť byl přijat název „umami“ – vedle kyselého, sladkého, hořkého a slaného vjemu. Výraz
pochází z japonštiny, kde „umai“ znamená chutný, delikátní. Specifický chuťový receptor tastemGluR4 byl popsán až v roce 2 000. Glutamát se používá hojně v mnoha kořenících směsích,
instantních pokrmech jako jsou polévky a omáčky, v konzervovaných jídlech, zejména zelenině,
v želatinových desertech a želé, ve zmrzlinách. Dále v masných výrobcích, výrobcích z ryb
a uzeninách. Je součástí mnoha aromat (smažené brambůrky) a slouží jako náhrada soli. Účinky
glutamanu byly testovány v řadě studií a ve 20. století tuto problematiku doprovázely velké spory
o toxicitě glutamanu. V rámci těchto studií a dalších studií pod záštitou Světové zdravotnické
organizace WHO nebyly shledány žádné negativní účinky na centrální nervový systém po jednorázové
vyšší konzumaci glutamanu v množství 10 g. Údaje o příjmu glutamanu závisí do značné míry na
regionálních i individuálních stravovacích zvyklostech. Průměrně konzumujeme 0,5 až 2 g přírodního
volného glutamanu a 0,5 – 1 g ve formě přídatné látky. Naše legislativa umožňuje používat kyselinu
L-glutamovou a její soli do potravin a nápojů (s výjimkou nealkoholických a dětské výživy do 3 let)
v množství do 10 g na kilogram nebo litr. Toto omezení se netýká kořenících přípravků a směsí koření,
kde neplatí žádné omezení a výše přídavku je regulována pouze požadovaným účinkem. Platí ovšem
předpoklad, že se nepodávají dětem do 3 let. Vzhledem k tomu, že nejčastější formou přidávané
kyseliny L-glutamové je její sodná sůl, mohou být výhrady k nadbytečnému množství konzumovaného
sodíku. Pokud se kyselina L- glutamová uplatňuje i jako součást náhrady soli, pak je výhodné použít
vápenaté nebo amonné soli.
Chromatografickými metodami lze v potravinářských výrobcích zjistit přítomnost a případně
i porovnat množství kyseliny glutamové a glutamátu. Detekce se provádí ninhydrinovou reakcí, kdy
pozorujeme vývoj červenofialového až modrofialového zbarvení.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: kádinky, odměrný válec, pipeta, skleněná tyčinka, lžička, nůžky, pinzeta,
rozprašovač, sušárna (fén), silufolová deska nebo filtrační papír, krycí sklíčko na kádinku/vanu.
Chemikálie a materiál: 1% roztok ninhydrinu (molární hmotnost 178,14 g/mol) v acetonu, 96%
ethanol, 1% kyselina L-glutamová (standard, molární hmotnost 147,13 g/mol), amoniak (vodný
roztok 25%), vzorky instantních polévek a dochucovadel.
Pracovní postup
Vzorek instantní polévky či jiných dochucovadel (Obrázek 6) rozmíchejte v malém množství vody
a nechejte usadit. Připravte si silufolovou desku nebo filtrační papír (asi 8x15 cm) k chromatografii
a 1 cm od spodního okraje vyznačte tužkou startovací čáru. Malou kapku připraveného vzorku
naneste kapátkem nebo mikropipetou na startovací čáru, nechejte kapku zaschnout (popřípadě
použijte fén) a postup zopakujte třikrát. Takto postupujte se všemi instantními polévkami, které máte
k dispozici. Vzorky nanášejte vedle sebe v dostatečné vzdálenosti, jako poslední naneste kapku 1%
roztoku kyseliny glutamové jako standardu. Chromatogram (Silufol či filtrační papír) vložte do vyšší
úzké kádinky nebo vyvíjecí vany s vyvíjecí směsí ethanol:amoniak v poměru 8:2 a přikryjte sklíčkem.
Asi po 2 hodinách vyjměte chromatogram z kádinky a detekujte. Postříkejte ho z rozprašovače 1%
roztokem ninhydrinu, poté usušte a zahřívejte v sušárně nebo pomocí fénu (Obrázek 7).
Obrázek 6. Použité vzorky instantních polévek či jiných dochucovadel – masox, Knorr instantní
brokolicová polévka, Nahrin vegeta (Gourmet-Mix), Nahrin instantní polévka (Klare Suppe vegetable).
Obrázek 7. Postup testování přítomnosti glutamátu v instantních polévkách. (A) Nanášení kapky
vzorku s následným sušením pomocí fénu na startovací čáru vyznačenou na silufolové desce. (B)
Silufol ve vyvíjecí vaně s vyvíjecí směsí ethanol:amoniak. (C) Po 2 hodinách vyvíjení a usušení je Silufol
připraven k detekci pomocí 1% roztoku ninhydrinu.
Vyhodnocení
Přítomnost kyseliny glutamové (glutamátu) obsažené v instantních polévkách či dochucovadlech se
projeví červenofialovým zbarvením po detekci ninhydrinem (Obrázek 8).
Obrázek 8. Chromatogram po detekci ninhydrinem. Vzorek 1 – kyselina L-glutamová, 2 – masox, 3 –
Just vegeta, 4 – Just instantní polévka, 5 – Knorr instantní polévka
2. Sacharidy
2.1 Izolace bramborového škrobu
Teoretický úvod
Škrob (amylum) je zásobní polysacharid rostlin. Polysacharidy jsou vysokomolekulární látky složené
z velkého počtu stejných nebo různých molekul monosacharidů, které se vzájemně váží
glykosidickými vazbami v přímé nebo rozvětvené řetězce. Škrob je bílá, ve vodě málo rozpustná
makromolekulární látka. Obecný vzorec škrobu je (C6H10O5)n. Je složený z dvou různých
polysacharidů: amylosy a amylopektinu, tvořených několika tisíci až desetitisíci molekul glukózy.
Struktury jsou uvedeny na Obrázku 9. Vlastnosti amylosy a amylopektinu jsou přehledně shrnuty
v Tabulce 1. Škrob kromě glukosy obsahuje v malém množství lipidy, proteiny a 25–35 % vody.
(A)
(B)
Obrázek 9. Lineární a šroubovicová sekundární struktura amylosy (A) a rozvětvená struktura
amylopektinu (B).
Tabulka 1. Porovnání vlastností amylosy a amylopektinu.
Vlastnost
Počet glukosových jednotek
Molární hmotnost
Glykosidické vazby
Amylosa
Obilné škroby 1000-2000
Bramborový škrob až 4500
5
6
10 -10
Převážně (1,4)-α-D-
Reakce s jódem
Náchylnost k retrodegradaci
Produkty působení β-amylasy
Barva modrá
Velká
Maltosa
Produkty působení glukoamylasy
Tvar molekuly
D-glukosa
Lineární; šroubovicová sekundární
struktura (na jednu otočku závitu
připadá 6 molekul glukosy)
0,03
Obsah fosforu (%)
Amylopektin
50000-1000000
7
8
10 -10
(1,4)-α-D(1,6)-α-DBarva červenofialová
Malá
Maltosa
β-hraniční dextrin
D-glukosa
Rozvětvený
0,2
Většina nativních škrobů obsahuje 20-25 % amylosy a 75-80 % amylopektinu. Existují speciálně
vyšlechtěné rostliny, které se liší obsahem škrobu, například vosková kukuřice či voskový ječmen mají
obsah okolo 5 % amylosy, naopak amylokukuřice a amyloječmen obsahují okolo 60-70 % amylosy.
Pro amylosu je rovněž charakteristická její rozpustnost v horké vodě. Díky spirálovitému řetězci
poskytuje amylosa reakci s jódem. Téměř minimálně podléhá esterifikaci kyselinou fosforečnou. Po
delší době stání ve vodném roztoku je amylosa vylučována ve formě bílého prášku retrodegradací.
Dochází ke změnám struktury a reologických vlastností. Příčinou je tvorba intermolekulárních
vodíkových vazeb přednostně u amylosy, velmi málo u amylopektinu. V případě škrobových disperzí
je tento děj označován jako retrodegradace a vede ke vzniku dvoufázového systému pevná látkakapalina. Na rychost retrodegradace má vliv zejména obsah a polymerační stupeň přítomné amylosy,
teplota, pH, obsah anorganických solí, povrchové napětí. Amylopektin tvoří v horké vodě stabilní
vysoce viskózní koloidní roztoky až mazy, které s jódem poskytují červenofialovou reakci.
Průmyslová výroba škrobu vychází z izolace z plodin, které mají vysoký obsah škrobu. Škrob se
přirozeně ukládá procesem asimilace v zásobních orgánech rostlin (semenech kukuřice, pšenice, rýže
a dalších nebo v hlízách brambor) ve formě škrobových zrn. Zvláště bohaté na škrob jsou brambory,
banány, obilniny a tapioka. Technologie izolace škrobu z jednotlivých surovin se liší v první fázi
uvolňování škrobu z hmoty, další technologické postupy vykazují společné rysy. Ze škrobu se tedy
vyrábí: produkty frakcionace škrobu (amylosa, amylopektin), termicky modifikované škroby
(extrudované), dextriny, (chemicky) modifikované škroby, substituované škroby, hydrolyzáty škrobu.
Co se týče využití škrobu, z celkové produkce se spotřebuje 50 % v rámci potravinářského průmyslu,
zbytek se uplatňuje v dalších odvětvích průmyslu, a to 30 % v papírenství, 10 % chemický průmysl
a zbylých 10 % ostatní odvětví. V České republice se tradičně vyrábí škrob bramborový (70 %)
a pšeničný (30 %), a to v celkovém objemu 4 0000 – 5 0000 tun za rok. V potravinářském průmyslu
mají největší využití hydrolyzáty škrobu, modifikované a substituované škroby. Modifikované škroby
se uplatňují zejména v mlékárenském průmyslu k výrobě sušených mléčných výrobků a instantních
směsí (vázání vody a zahušťování). Pekárenský průmysl využívá škrob jako vaznou látku do těst,
zlepšovací přísadu do mouk pro zvýšení elasticity lepkové složky. Také se využívá pro výrobu sladidel.
V papírenském průmyslu slouží pro klížení povrchu a výrobě vlnité lepenky. Další využití škrobu je
v textilním průmyslu a při výrobě lepidel. V zemědělství se využívají termicky upravené škroby jako
komponenty při výrobě krmiv. Pro škrobení prádla se používají především termicky modifikované
škroby a dále i škroby oxidované. Velmi důležité je uplatnění maltodextrinů ve zdravotnictví, jako
součást tekuté výživy.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: nůž, struhadlo, škrabka na brambory, kádinky, lžička, gáza nebo cedník.
Chemikálie a materiál: brambora, voda.
Pracovní postup
Bramboru oloupejte nožem či oškrábejte škrabkou a nastrouhejte na jemném struhadle do kádinky.
K nastrouhané hmotě poté přidejte trochu vody a promíchejte. Směs přeceďte do čisté kádinky přes
gázu či cedník. Filtrát nechte 10 minut stát a poté pozorujte.
Vyhodnocení
Na dně kádinky s filtrátem se usadí bílý prášek – škrob. Hlíza brambory obsahuje až 20 % škrobu.
Škrob se skládá z amylosy a amylopektinu.
2.1 Pozorování škrobových zrn pod mikroskopem
Teoretický úvod
Škrob je nejdůležitější zásobní látkou vyšších rostlin. Slouží rostlině k uložení energie získané
v průběhu procesu fotosyntézy. Škrobová zrna se tvoří v buňce v amyloplastech. Škrob se ukládá
v zásobních orgánech rostlin ve formě zrn, která mají pro daný rostlinný druh charakteristický tvar.
Podle počtu iniciálních krystalizačních jader se tvoří buď jednoduchá škrobová zrna (jedno
krystalizační jádro), nebo složená škrobová zrna (několik krystalizačních jader) (Obrázek 10).
U složených škrobových zrn počet elementárních zrn, která je tvoří, značně kolísá v rozpětí řádů
jednotek až tisíců. U některých škrobových zrn můžeme pozorovat jednotlivé vrstvy, z nichž je
škrobové zrno složeno - tato vrstevnatost je dána kolísajícím obsahem vody. Podle pozice původního
krystalizačního centra pak můžeme rozeznat zrna koncentricky vrstevnatá a excentricky
vrstevnatá. Vlivem pnutí se často uvnitř větších zrn vytváří rhexigenní dutina. V průběhu vývoje
mohou škrobová zrna narůst do takových rozměrů, že dojde k protržení membrán amyloplastů a tím
k uvolnění škrobových zrn do cytoplasmy. Škrobová zrna mají často pro daný rostlinný druh
charakteristický tvar. V Tabulce 2 je uvedena charakteristika škrobů různých plodin, a to včetně
velikosti a průměru škrobových zrn.
Ve studené vodě škrobová zrna mírně bobtnají, přijímají zhruba 30 % vody (vztaženo na
hmotnost škrobu). Se zvyšující se teplotou nabývá bobtnání na intenzitě. Do teploty 60°C, která je
počáteční teplotou mazovatění, je celistvost škrobových zrn neporušena. Po dosažení této teploty
dochází k porušování vodíkových můstků a ztrátě původní struktury, zrna prudce zvětšují svůj objem
a uvolněná amylosa difunduje do roztoku. Dalším zvyšováním teploty pokračuje hydratace
škrobových zrn, následně dochází ke ztrátě jejich integrace, praskání a roztrhávání. Proces, při kterém
tento proces zasáhne všechna škrobová zrna v rozmezí teplot 10-15°C, se nazývá mazovatění škrobu.
Tento děj je již irreverzibilní. Teplota mazovatění je pro různé škroby rozdílná, pohybuje se v rozmezí
55-70°C, přičemž nejnižší teplotu má žitný škrob. Při mazovatění škrobu jsou důležitými faktory pH
prostředí, přítomnost solí, tuků a poměr škrob:voda. Škrobový maz je čirá viskózní kapalina. Při
ochlazování vzniká škrobový gel, tvořen spojitou trojrozměrnou sítí, která je vysoce viskózní a tvoří
pastu.
Obrázek 10. Struktura škrobového zrna kukuřice (a), pšenice (b), bramboru (c), rýže (d).
Tabulka 2. Charakteristika škrobových zrn různých plodin.
Plodina
Obsah škrobu (%)
Kukuřice
Pšenice
Brambor
Rýže
86-75
70-62
20
45
Velikost
škrobových zrn
(µm)
5-25
3-35
5-100
3-8
Průměr škrobových
zrn (µm)
Tvar zrn
15
7, 20
36
Polygonální
Eliptický
Oválný
Nepravidelný
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: nůž, preparační jehla, podložní a krycí sklíčka, žiletka, kapátko.
Chemikálie a materiál: brambor, obilky ovsa či pšenice, zrnka rýže, kukuřice, mouka, pudinkový
prášek, voda, Lugolův roztok (5 g jodu a 10 g jodidu draselného v 100 ml destilované vody, uchováme
v tmavé lahvičce).
Přístroje: mikroskop.
Pracovní postup
Rozřízněte hlízu bramboru a pomocí preparační jehly seškrábněte trochu šťávy z řezné plochy čerstvě
rozřezané hlízy bramboru a rozetřete ji na podložní sklíčko. Přikryjte krycím sklíčkem. Tvar
škrobových zrn pozorujte pod mikroskopem. Preparát pro zvýraznění škrobových zrn probarvěte
Lugolovým roztokem tak, že na jednu stranu krycího sklíčka kápnete malou kapku barviva a na druhé
straně přiloženým filtračním papírem odsáváte přebytečnou vodu. Tímto způsobem dosáhnete
plynulejšího probarvení škrobových zrn.
Na jiná podložní sklíčka naneste velmi malá množství pšeničného, rýžového nebo kukuřičného
škrobu. Lze také použít trochu mouky či pudinkového prášku rozmíchaného ve vodě k pozorování
škrobových zrn. V případě použití obilek ovsa, rýže či jiné obiloviny rozpulte obilku a preparační
jehlou seškrábněte trochu endospermu (vnitřní část obilky). Ve všech případech pozorujte při malém
zvětšení. Zakreslete nebo vyfotografujte jednotlivé tvary zrn (Obrázek 11).
Vyhodnocení
Obrázek 11. Škrobová zrna lilku bramboru, kukuřice, rýže, pšenice, mouky a pudinkového prášku.
Zvětšeno 20x.
3. Stanovení a důkazy vitamínů
Teoretický úvod
Vitamíny jsou nízkomolekulární organické látky, které společně s cukry, tuky a bílkovinami jsou
základní složkou lidské potravy. V lidském těle mají nezastupitelnou funkci jako součást
biokatalyzátorů. Výraz vitamin pochází přibližně z roku 1911, kdy polský biochemik Kazimierz Funk
objevil vitamin B1 v otrubách rýže. Funk navrhl název vitamín podle latinského vital a amine =
„životně důležité aminy“. Ačkoli podle dnešních poznatků nejde o aminy, název se ujal. Tento termín
byl později rozšířen na všechny podobné látky (vitamíny A, B, C, D, E, K a pseudovitamíny). Historie
objevení vitamínů sahá o několik tisíciletí zpět, ovšem skutečné vědecké studium započalo až
s rozvojem chemie v 19. a na začátku 20. století a vyvrcholilo poznáním jednotlivých přídatných
potravinových faktorů, které byly pojmenovány podle abecedy v tom pořadí, v jakém byly objeveny.
Ovšem projevy nedostatku těchto látek byly známy mnohem dříve. Šeroslepost, porucha vidění za
šera, způsobovaná nedostatkem vitaminu A, byla popsána už ve starém Egyptě v roce 1600 př. n. l.,
ale zkušenosti měli i staří Číňané, kteří ji léčili podáváním jater zvířat, popř. inhalováním par
vystupujících z vařících se jater. Nemoc zvaná kurděje byla známá již několik tisíc před naším
letopočtem. Trpěli jí hlavně námořníci při dlouhých plavbách, kdy byl problém obstarat pro posádku
čerstvé potraviny. Zánět dásní, vypadávání zubů a zvýšená krvácivost jsou typickými projevy
nedostatku vitamínu C. Tento syndrom byl popsán již v roce 450 př. n. l. filosofem Aristotelem.
Podle farmakologického slovníku představují vitamíny esenciální složku potravy, která
v organismu plní katalytické funkce. Denní potřeba vitamínů, s výjimkou vitamínu C, je v rozmezí od
několika mikrogramů do několika miligramů. Existuje 13 základních typů vitamínů. Lidský organismus
si, až na některé výjimky, nedokáže vitamíny sám vyrobit, a proto je musí získávat prostřednictvím
stravy. Z chemického hlediska patří vitaminy k různým druhům sloučenin, mezi nimiž není žádná
chemická příbuznost. Tím zaniká možnost jejich klasifikace podle strukturního hlediska. Začalo se
proto používat třídění podle některých fyzikálních vlastností, především podle rozpustnosti. Podle ní
dělíme vitaminy na rozpustné ve vodě (hydrofilní) a rozpustné v tucích (lipofilní). Kromě rozpustnosti
se však tyto dvě skupiny liší ještě v dalších základních biologických vlastnostech. Vitamíny rozpustné
v tucích mohou být skladovány. Jejich nadbytečný příjem může proto vést k hypervitaminózám
a zejména v případě vitamínu A a vitamínu D vyvolat vážné poruchy organismu. Množství potřebné
pro optimální funkci lidského organismu se pro jednotlivé vitamíny liší. Jejich rozdílné role
v metabolismu mají vliv na to, ke které fyzikální veličině se vztahuje jejich denní doporučená dávka
(DDD). U vitamínů B1, B2, B3 je DDD vztažena na denní spotřebu kalorií, u vitamínu B6 na denní
spotřebu gramů bílkovin obsažených ve stravě, v případě kyseliny pantothenové a vitaminu K je DDD
vztažena k hmotnosti člověka.
Než byla objasněna struktura vitamínů, bylo zavedeno jejich označování písmeny abecedy,
přičemž vitamíny se stejnými nebo podobnými fyziologickými vlastnostmi byly ještě odlišovány
číselnými indexy. Později byly zavedeny triviální názvy, často i několik různých pro jednu a tutéž látku.
Řada z nich se už nepoužívá, řada z nich se ale uchytila a bývá užívána častěji, než abecední
označování. Termín “vitamín” se dříve používal pro řadu chemických látek, které nesplňovaly kritéria
předepsaná pro vitaminy. U řady sloučenin dříve popisovaných jako vitamíny (např. vitamin G, M, T)
se zjistila aktivita již známého vitamínu (např. vitamín G je identický s vitamínem B2 (riboflavinem),
vitamín M, Bc, T je identický s kyselinou listovou). Na konci minulého století bylo v literatuře uváděno,
že existuje 13 různých vitamínů: A, C, D, E, K a 8 různých vitaminů skupiny B. Další výzkumy přinesly
třináct vitamínů skupiny B, od vitaminu B12 a niacinu až 6 dalších se forem, které působí rozdílně.
Téměř z 500 karotenů je 60 uznáno jako předstupně vitamínu A, zhruba 110 karotenů je považováno
za účinnější než samotný vitamin. Od vitamínu C a D se vyskytují čtyři různé varianty a dvanáct od
tokoferolu.
Vitamíny jsou organické sloučeniny rozmanitých struktur, avšak s charakteristickou strukturální
specifitou. Sebemenší změna ve struktuře molekuly způsobí změnu jejich funkce i negativním
směrem. V přírodě se vyskytuje řada látek, které snižují nebo zcela ruší účinek vitamínů. Tyto látky se
nazývají antivitamíny a mohou být připraveny i synteticky. Podle způsobu účinku se tyto látky dělí do
tří skupin: a) enzymy rozkládající vitamíny - askorbátoxidasa, peroxidasa, b) látky tvořící s vitamíny
nevyužitelné komplexy - avidin, c) látky strukturně podobné vitamínům, které mohou zaujímat místo
vitamínů v biologických systémech (ovšem bez plnění jejich úlohy) tzv. kompetitivní inhibitory sulfonamidy, antibiotika, dikumarol.
V potravinách se vitamíny vyskytují v množství µg·kg-1 po stovky až tisíce mg·kg-1 dle druhu
vitamínu, ročního období, druhu potraviny a způsobu jejího zpracování. Vitamíny se vyskytují jak
volné, tak i vázané zejména na bílkoviny a sacharidy. Vitamíny jsou labilní složkou potravin, zejména
vitamíny rozpustné ve vodě dochází ke ztrátám během technologického i kulinárního zpracování
výluhem, u vitamínů rozpustných v tucích pak jejich oxidací. Nedostatek některého vitamínu se
projeví tzv. hypovitaminózou, avšak je-li vitamín přechodně nedostatečně dodáván, hrozí tzv.
avitaminóza projevující se poruchami některých biochemických procesů. Většina příznaků
avitaminózy po dodání chybějícího vitamínu vymizí, v případě dlouhodobé avitaminózy hrozí
nenávratné změny organismu až smrt. Příčinou nedostatečné resorpce vitamínů bývají většinou
onemocnění zažívacího ústrojí. Naopak, při nadbytečném příjmu vitamínů hrozí tzv. hypervitaminóza,
která rovněž vede k závažným poruchám biochemických procesů až smrti. V Tabulce 3 a 4 jsou
shrnuty doporučené denní dávky, zdroje a funkce jak vitamínů rozpustných v tucích a ve vodě.
Rovněž jsou uvedeny následky hypervitaminózy a avitaminózy. Obrázky 12 a 13 zobrazují vybrané
strukturní vzorce vitaminů.
Tabulka 3. Charakteristika vitamínů rozpustných v tucích.
Vitamín
Vitamín A
(retinol)
Vitamín D
(kalciferol)
Vitamín E
(tokoferol)
Vitamín K1
(antihemorrhagický,
fylochinon)
(a)
(c)
DDD
0,8 mg
5 µg
Zdroj
Mléčný tuk,
vaječný žloutek,
játra, rybí olej, v
barevné zelenině
jako provitamin
(mrkev,
brokolice, špenát)
Rybí tuk,
kvasnice, vejce,
mléko;
syntéza v kůži
působením UV
záření
Funkce
Hypervitaminóza
Avitaminóza
Nezbytný pro
tvorbu barviv na
sítnici, podílí se na
syntéze bílkovin v
kůži a sliznicích
Praskání a
krvácení rtů,
podrážděnost,
poruchy vývoje
plodu v
těhotenství
Šeroslepost,
rohovatění
kůže a sliznic,
poškození
skloviny
Vstřebávání
vápníku a fosforu
v těle
Zvápenatění
měkkých tkání,
narušení růstu,
poškození ledvin
Křivice,
odvápňování a
měknutí kostí
12 mg
Rostlinné oleje,
vlašské ořechy,
obilné klíčky,
listová zelenina
Antioxidant,
zvyšuje plodnost,
podporuje činnost
nervového
systému
75 µg
Listová zelenina,
kvasnice; tvorba
mikroorganismy
ve střevě
Důležitý pro
srážení krve,
mineralizaci kostí
Žaludeční potíže,
průjmy, zhoršené
vstřebávání
vitamínu K →
snížení krevní
srážlivosti
Iniciace
hemolytické
anémie,
hyperbilirubinémie
Porucha
funkce
vaječníků a
varlat
Zvýšená
krvácivost,
krvácení do
tělních dutin
(b)
(d)
Obrázek 12. Strukturní vzorce vitamínů rozpustných v tucích. (a) vitamín A (retinol), (b) vitamín D
(kalciferol), (c) vitamín E (α-tokoferol), (d) vitamín K1.
Tabulka 4. Charakteristika vitamínů rozpustných ve vodě.
Vitamín
B1 (thiamin,
aneurin)
B2 (riboflavin,
laktoflavin)
DDD
1,1 mg
1,4 mg
Zdroj
Obiloviny (klíčky),
kvasnice, játra,
srdce, ledviny,
libové vepřové
maso
Mléko, listová
zelenina,
kvasnice, játra,
srdce a ledviny
Funkce
Hypervitaminóza
Ovlivňuje
metabolismus
cukrů v CNS a ve
svalech
Součást enzymů v
dýchacím řetězci
→ nezbytný pro
základní buněčný
metabolismus
Avitaminóza
Zvýšená únava,
křeče svalstva,
zánět nervů až
nemoc beriberi
Malinový jazyk,
bolavé ústní
koutky,
poruchy ústní
sliznice,
světloplachost
+
Syntéza NAD a
+
NADP →
koenzymy
dehydrogenas,
snižuje množství
cholesterolu v
krvi
Aktivní forma k.
pantothenové je
koenzym A →
metabolismus
sacharidů, lipidů
Zánět nervů,
duševní
poruchy,
záněty sliznic a
kůže, těžké
průjmy
16 mg
Játra, ledviny,
libové maso,
ryby, kvasnice,
houby
B5 (kyselina
pantothenová)
6 mg
Játra, kvasnice,
hrách, maso,
ryby, mléko,
vejce
B6 (pyridoxin)
1,4 mg
Mléko, kvasnice,
obilné klíčky,
maso, luštěniny
Podporuje účinek
vitamínu B1 a B2
Chudokrevnost
Perniciosní
anémie
B3 (kyselina
nikotinová, vitamín
PP, niacin)
B9 (kyselina listová,
k. folová)
0,2 mg
Listová zelenina,
kvasnice, játra
Ovlivňuje
metabolismus
aminokyselin a
nukleových
kyselin, klíčová
pro tvorbu
červených krvinek
B12 (kobalamin)
2,5 µg
Játra, maso,
ústřice; tvorba
činností bakterií
Klíčový pro
krvetvorbu
C (kyselina
askorbová)
80 mg
Šípek, syrové
ovoce a zelenina
Metabolismus
aminokyselin,
udržuje dobrý
stav vaziva a
chrupavek,
podporuje tvorbu
protilátek
H (biotin, B7)
50 µg
Kvasnice, játra,
ledviny
Podporuje růst a
dělení všech
živočišných buněk
Pálení
chodidel,
poruchy růstu,
dermatologické
poruchy
Pomalé hojení
zánětů,
zhoršená
regenerace
sliznic
Únava, snížená
odolnost proti
nakažlivým
chorobám,
krvácení,
vypadávání
zubů, smrtelné
onemocnění
kurděje
(skorbut)
Záněty kůže,
papil jazyka,
únava,
deprese,
svalové bolesti,
nechutenství
(a)
(c)
(b)
(d)
Obrázek 13. Strukturní vzorce vitamínů rozpustných ve vodě uplatňujících se jako prekursory
koenzymů. (a) vitamín B2 (riboflavin), (b) vitamín B3 (niacin), (c) vitamín B5 (panthotenová kyselina),
(d) vitamín B6 (pyridoxin).
3.1 Kvantitativní důkaz vitamínů
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: třecí miska s tloučkem, filtrační aparatura, kádinky, zkumavky, stojánek na
zkumavky, odměrná baňka, struhadlo, pH papírek.
Chemikálie a materiál: benzín, konc. H2SO4, Fehlingovo činidlo (vznikne smícháním činidla I a II), 30%
H2O2, 5 % roztok dusičnanu stříbrného (AgNO3, molární hmotnost 169,87 g/mol), 12% HCl, 0,02 M
manganistan draselný (KMnO4, molární hmotnost 158,034 g/mol), anilín, nasycený roztok chloridu
antimonitého (SbCl3, molární hmotnost 228,11 g/mol) v chloroformu, amoniak (vodný roztok 25%),
mrkev, pomeranč, Celaskon, Spofavit (vitamínový doplněk stravy z lékárny), rybí tuk, šípky, kvasnice.
Fehlingovo činidlo I (4 g síranu měďnatého pentahydrátu CuSO4.5H2O rozpustíme v 50 ml vody
a doplníme na 100 ml)
Fehlingovo činidlo II (22,9 g vinanu draselnosodného KNaC4H4O6 a 15 g hydroxidu sodného NaOH
rozpustíme v 75 ml vody a doplníme na 100 ml)
Činidlo I (50 ml 5,8% NaHCO3 a 50 ml 4% NaOH).
Činidlo II (kyselina p-diazobenzensulfanová, 0,9 g kyseliny sulfanilové rozpustíme v 9 ml konc. HCl
a doplníme vodou do 100 ml). Potom 1,5 ml tohoto roztoku nalejeme do 50 ml odměrné baňky stojící
v ledu a přidáme 1,5 ml čerstvě připraveného 5% roztoku NaNO 3. Dále během 1 minuty přidáme
postupně za chlazení vodu po značku 50 ml. Ponecháme ještě 15 minut v ledu za občasného
protřepání.
Pracovní postup
1. V mrkvi, Spofavitu a šípku dokažte vitamín A:
A) Dužninu šípku a kousek mrkve najemno nastrouhejte a dejte zvlášť do dvou zkumavek a do třetí
nasypte trochu prášku Spofavitu a přilijte 3 ml benzínu. Důkladně protřepejte a nechejte ustát
3 minuty. Potom benzín slijte na hodinové sklíčko a ponechejte odpařit. Pak na sklíčko přikápněte
několik kapek kyseliny sírové.
B) Asi 10 kapek rybího oleje přidejte k 3 ml nasyceného chloroformovému roztoku chloridu
antimonitého.
2. Důkaz vitamínu C:
A) Důkaz v Celaskonu, Spofavitu.
B) Důkaz v přírodním materiálu (pomerančová šťáva). Nejprve musíte kyselinu L-askorbovou vázanou
v askorbigenu uvolnit např. působením kyseliny chlorovodíkové.
a) 3 ml dusičnanu stříbrného a několik kapek amoniaku + 2 ml roztoku vitamínu C – zahřejte – vzniká
černá sraženina.
b) 2 ml Fehlingova činidla + 2 ml roztoku vit. C – zahřejte – Fehlingův roztok se odbarvuje, vylučuje se
červený oxid měďný.
c) 1 g šípků nebo citrónu rozdrtíte v misce s pískem a přidejte po částech 25 ml 12% HCl. Zfiltrujte
a takto získaný filtrát rozdělte na dvě části. K první části filtrátu ve zkumavce přidejte stejný objem
30% H2O2. Povařte asi 3 minuty a přidejte po kapkách 0,02 M roztok manganistanu draselného.
Současně k druhé části filtrátu přidávejte jen 0,02 M roztok manganistanu draselného. Sledujte obě
zkumavky a pozorujte odbarvení roztoků KMnO4 v obou zkumavkách. Vysvětlete rozdílné chování.
3. Důkaz vitaminu B1 (thiamin):
Sušené pivovarské kvasnice rozmíchejte s vodou a nechejte stát 3 hodiny za občasného promíchání
(50 ml vody na 5 g kvasnic). Roztok zfiltrujte a filtrát odpařte do sucha. Před reakcí zřeďte vodou (10
ml) a okyselte 12% HCl do pH 3 (použijte pH papírky).
Do zkumavky dejte 1 ml činidla I a 10 kapek činidla II. Přidejte 20 kapek extraktu z kvasnic. Je-li
přítomen B1, vznikne žluté zbarvení, které přechází během 2-3 minut v růžové.
4. V roztoku Spofavitu a Infadinu (rybím tuku) dokažte vitamín D:
Do zkumavek se Spofavitem či rybím tukem přidejte 5 ml koncentrované kyseliny sírové a povařte 3040 sekund. Žlutá barva se mění v rudou.
Vyhodnocení
1A) Karoten, který se v benzínu rozpustil, se po odpaření benzínu usadí v podobě kruhů. Po přidání
kyseliny sírové se zbarví modře – fialově až hnědě.
1B) Modré zbarvení roztoku dokazuje přítomnost vitamínu A. Po zmizení modrého zbarvení se roztok
zbarví červeně, což dokazuje přítomnost vitamínu D.
2A,B) Kyselina L-askorbová má silné redukční účinky, ztrátou vodíku se dehydrogenuje na kyselinu Ldehydroaskorbovou. Pozn. Reakce není specifická, dává ji řada jiných látek, např. fruktosa, laktosa,
pepsin aj.
3) Thiamin poskytuje při reakci s diazotovanou kyselinou sulfanilovou sloučeninu, která je růžově
zbarvena vzniklým azobarvivem.
3.2 Ověření množství vitamínu C v ovoci, zelenině a nápojích
Teoretický úvod
Vitamín C řadíme mezi vitamíny rozpustné ve vodě. Nejčastěji se setkáváme s označením kyselina
L-askorbová. Jedná se o γ-lakton kyseliny 2-oxo-L-gulonové, jehož biosyntéza probíhá u řady
organismů, avšak s výjimkou člověka, morčete, primátů, indického netopýra, některých ptáků
a bezobratlých (Obrázek 14).
Obrázek 14. Schéma biosyntézy kyseliny askorbové u obratlovců a rostlin.
Kyselina askorbová má čtyři možné stereoisomery (asymetrický uhlík C-4 a C-5), z nichž aktivitu
vitamínu C vykazuje pouze kyselina L-askorbová (γ-lakton L-threo-2-hexenonové kyseliny, dříve
označované cerit-aminová, 2-keto-L-gulonová, L-xylo-2-hexulosonová a později L-xylo-askorbová
kyselina). Její isomer D-askorbová kyselina a druhý pár enantiomerů, tj. L- a D-isoaskorbová
(nazývané též L- a D- erythorbová kyselina a dříve označované jako L- a D-arabino-askorbová
kyselina) aktivitu vitamínu C nevykazují. Pod názvem vitamín C je nejen označována kyselina
L-askorbová, ale také její celý reversibilní redoxní systém zahrnující produkty její oxidace –
L-askorbylradikál čili kyselinu L-monodehydroaskorbovou a také produkt dvouelektronové oxidace
kyselinu L-dehydroaskorbovou. Ve fyziologickém prostředí se chovají kyselina askorbová
a askorbylradikál jako anionty. Tvoří bezbarvé krystaly dobře rozpustné ve vodě (1 g na 3 ml vody),
špatně rozpustné v alkoholu (1 g na 50 ml) a ostatních organických rozpouštědlech. Ve vodném
prostředí se chová jako středně silná kyselina s disociačními konstantami pK1 = 4,17 a pK2 = 11,57.
Vitamín C je nejznámější a nejrozšířenější ze všech vitamínů, jedná se o nejčastěji používaný
potravinový doplněk. Průmyslově se vyrábí z D-glukosy, která je katalytickou dehydrogenací
převedena na D-sorbitol. Poté následuje mikrobiální oxidace díky Acetobacter suboxidans, která vede
k produkci L-sorbosy. L-sorbosa v reakci s acetonem v prostředí kyseliny sírové poskytuje 2,3:4,6-bis(O-isopropyliden)-α-L-sorbofuranosu. Oxidací tohoto produktu pomocí manganistanu draselného
v alkalickém prostředí se získá kyselina diaceton-2-oxo-L-gulonová. Po hydrolýze chránících skupin
(ketalů) vzniká kyselina L-askorbová.
Obsah vitamínu C v potravinách je velmi proměnlivý, závisí na geografických podmínkách,
skladování, tepelné úpravě a na mnoha dalších faktorech. Například vařením se ničí až 60 % vitamínu
C, sušením až 50 %, šetrnější je dušení v páře. Velké ztráty způsobuje tepelná konzervace.
Nejšetrnější k vitamínu C je mražení. Nejvyšší obsah vitamínu C má čerstvé ovoce a zelenina.
Absolutně nejvyšší koncentrace byla nalezena v plodech barbadoské třešně aceroly lysé (Malpighia
punicifolia). Z jednoho hektaru se sklidí průměrně 25 tun ovoce, ze kterého se získá asi 2,5 t šťávy
a z ní asi 500 kg askorbové kyseliny (dehydroaskorbové). Nejvíce vitamínu C obsahují ještě nezralé
zelené plody. Bohatým zdrojem vitamínu C jsou šípky (8000 mg/kg), černý rybíz (1360 mg/kg), naťová
petržel (1369 mg/kg), avšak vzhledem k příležitostné konzumaci malého množství nejsou příliš
významné pro pokrytí denní potřeby. Větší význam mají zdroje s průměrným obsahem, které se
konzumují pravidelně a ve větším množství, například brambory (rané 232 mg/kg, podzimní X-XII
126 mg/kg, IV-VII 65 mg/kg). Co se týče potravin živočišného původu, větší množství vitamínu
C obsahují játra (hovězí 300 mg/kg) a čerstvá krev. Čerstvě nadojené mléko je také bohatým zdrojem
vitamínu C, ale vlivem světla dochází k jeho oxidaci.
Co se týče doporučeného denního dávkování vitamínu C, k prevenci proti kurdějím se
doporučuje přijímat 10-12 mg denně. Avšak pro správné fungování organismu je tato dávka
nedostačující. Podle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví České republiky je průměrná denní potřeba
60 mg. Pro stanovení doporučených dávek jsou podle Carra a Freie (The American Journal of Clinical
Nutrition, 1999) vhodnějším podkladem výsledky epidemiologických studií (ověřování spotřeby
jednotlivých potravin v závislosti na stravovacích zvyklostech, ročním období atd.), protože odrážejí
skutečný příjem vitamínu C v potravě, kdežto klinické studie podávají hodnotné informace
o možnostech doplňování preparáty obsahujícími vitamín C. Při podání 100 mg kyseliny askorbové
za den stoupá její koncentrace v plazmě téměř lineárně až do hodnoty okolo 50 μmol/l, při které
dochází k překročení ledvinového prahu a začne stoupat vylučování nemetabolizované kyseliny
askorbové v moči. Při podání vitamínu C v dávkách vyšších než 200 mg se vylučování kyseliny
askorbové močí rapidně zvyšuje a doplňování se tak míjí účinkem. Klinické příznaky nedostatku se
projeví, když klesne celková zásoba v těle pod 300 mg. Dlouhodobý nedostatek vitamínu C vyvolává
u dětí i dospělých kurděje. Pokud člověk po dobu 4-5 měsíců trvale postrádá vitamín C v potravě,
dochází ke smrti. V případě konzumace nadbytečného množství dochází ke gastrointestinálním
potížím. Množství vitamínu C, které člověk snese, lze stanovit tzv. tolerancí střeva – projevem
dyspeptických potíží. Horní hranice příjmu vitamínu C byla pro děti do 3 let stanovena ve výši 400 mg
na den, pro dospělé 2000 mg na den. V poslední době se začíná užívat vitamín C s prodlouženým
účinkem, resp. s pomalou absorpcí.
Hlavní funkcí vitamínu C v lidském organismu je účast v oxidoredukčních dějích. Kyselina
askorbová i její isomery a deriváty mohou reagovat s volnými radikály, které způsobují oxidaci lipidů
a dalších oxidovatelných složek potravin a působí jako antioxidanty. Navíc v kombinaci s tokoferoly
působí mnohem účinněji. Kyselina askorbová se podílí rovněž na hydroxylaci prolinu, aminokyseliny,
která je hlavní složkou kolagenu nezbytného pojiva v kůži, kostech, kloubech, šlachách a
chrupavkách. Pokud není v těle dostatek vitamínu C, nedochází k hydroxylaci prolinu a špatně se
tvoří kolagen. Je známo, že železo obsažené v ovoci, zelenině a obilninách se v těle poměrně špatně
vstřebává. Vitamín C zlepšuje vstřebávání železa až o 85%, při jeho nedostatku se doporučuje zvýšit
příjem vitamínu C díky namísto zvýšení spotřeby železa, což může být i rizikové. Další funkcí vitamínu
C je napomáhání syntézy karnitinu z aminokyseliny lysinu. Karnitin transportuje mastné kyseliny do
mitochondrií, kde dochází k jejich degradaci. Bylo popsáno, že konzumace dostatečného množství
vitamínu C chrání před srdečními chorobami daleko účinněji než udržování nízké hladiny cholesterolu
dietou.
Vitamín C je rovněž bohatě využíván v potravinářství, kde se řadí mezi tzv. přídatné látky
(aditiva), konkrétně do skupiny antioxidantů. Označuje se jako E300, E301 značí askorbát sodný, E304
estery kyseliny askorbové askorbylpalmitát a askorbylstearát. Díky svým vlastnostem – vitamín,
antioxidant, chelatační činidlo, má uplatnění v konzervárenství, kvasné technologii a technologii
masa, tuků a cereálií. Hydrofilní sůl askorbátu sodného a lipofilní kyselina 6-palmitoyl-L-askorbová
inhibují vznik nitrosaminů v nakládaném mase a masných výrobcích. Hojně se přidává do ovocných
džusů, konzervovanému či mraženému ovoci, aby nedošlo během skladování a zpracování ke
změnám aromat. V množství 20-30 mg/kg se přidává do piva pro zabránění tvorby chladových a
oxidačních zákalů, také nežádoucích změn chuti a aromat. Kyselina askorbová je využívána rovněž i
při výrobě vína, kdy umožňuje snížení použití oxidu siřičitého k síření. V množství 10 – 100 mg/kg se
používá v pekařství jako prostředek zlepšující pekařské vlastnosti mouky. Askorbylpalmitát se používá
v množství 0,006 – 0,04 % jako antioxidant tuků.
3.2.1 Důkaz vitamínu C v ovoci a zelenině
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: třecí miska s tloučkem, filtrační aparatura, nálevka, zkumavky.
Chemikálie a materiál: 5% roztok chloridu železitého FeCl3, 5% roztok hexakyanoželezitanu
draselného K3[Fe(CN)6], tableta Celaskonu, vzorek ovoce či zeleniny (jablko, citron, cibule, mrkev, …).
Pracovní postup
Rozetřete asi 5 g vzorku s 5 ml destilované vody v třecí misce a směs přefiltrujte do čisté zkumavky.
K filtrátu přidejte 2 ml roztoku chloridu železitého a potom stejný objem roztoku
hexakyanoželezitanu draselného. Zaznamenejte barevné změny ve zkumavce a porovnejte barevné
výsledky u použitých vzorků ovoce a zeleniny s kontrolním vzorkem (Celaskonem). Popište chemický
průběh reakce.
Vyhodnocení
Po přidání obou směsí roztoků k vitamínu C (Obrázek 15) se směs zbarví temně zeleně. Časem
přechází zbarvení do modrozelené (Berlínská modř). Barevné změny jsou důsledkem přítomnosti
vitamínu C jako redukčního činidla.
FeCl3
Vitamín C
FeCl2 + K3[Fe(CN)6]
(zelená barva)
FeCl2
FeII3[FeIII(CN)6]-III 2 + 3K+
K[FeIIIFeII(CN)6]
(Berlínská modř)
Obrázek 15. Důkaz vitamínu C. (A) Rozetřené vzorky jablka, nektarinky, kiwi, banánu a mrkve v třecí
misce. (B) Vzorky po filtraci do zkumavky + zkumavka s tabletou Celaskonu jako vit. C. (C) Filtrát s 2
ml roztoku chloridu železitého. (D) Vzorky po přídavku 2 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného,
kdy vzniká modrozelená Berlínská modř.
3.2.2 Množství vitamínu C v nápojích
V potravinářském průmyslu se kyselina askorbová (vitamín C) používá k omezení oxidace
v potravinách. Snižuje oxidaci tuků, přidává se proto zejména do uzenin, ve kterých pomáhá udržovat
červenou barvu. Množství vitamínu C lze určit titrací po odečtení z kalibrační křivky standardu.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: titrační baňka, byreta, pipeta.
Chemikálie a materiál: tablety Celaskonu, 0,1% roztok vitaminu C (pomerančový džus, limonáda), 6 M
kyselina octová, 1% roztok škrobu, roztok jodu I2 v jodidu draselném KI (1% KI, 0,125% I2).
Pracovní postup
Nejprve si připravte kalibrační křivku pomocí titrace standardu Celaskonu: do 125 ml titrační baňky
odpipetujte 25 ml standardu o známé koncentraci, přidejte 2 ml 6 M kyseliny octové a 3 ml 1%
škrobu. Pomocí byrety titrujte roztokem jodu v KI až do modrého zbarvení a zaznamenejte spotřebu.
Zakreslete titrační křivku.
Pro vlastní titraci pro určení kvantitativního množství vitamínu C v nápoji použijte přefiltrovaný džus,
limonádu či šťávu z kompotu. Použijte postup stejný jako pro titraci Celaskonu, podle spotřeby
titračního roztoku jodu v KI odečítejte příslušnou koncentraci vitamínu C.
Vyhodnocení
Pro titraci se používá roztok jodu v KI a detekuje se pomocí reakce jodu se škrobem (do modrého
zbarvení v bodě ekvivalence).
Kyselina askorbová v nápojích reaguje kvantitativně s jodem dle rovnice:
Kyselina askorbová
Kyselina dehydroaskorbová
3.2.3 Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové
Titrační stanovení kyseliny L-askorbové je založeno na její snadné oxidovatelnosti za vzniku kyseliny
L-dehydroaskorbové. Jako odměrné činidlo se používá roztok sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu,
která je v neutrálním a alkalickém prostředí modrá, v kyselém prostředí růžová. Redukcí kyselinou
L-askorbovou přechází modře zbarvená sůl na bezbarvou leukoformu. Ekvivalenční bod je určen
vznikem růžového zbarvení kyselého titrovaného roztoku (kyselina L-askorbová je rozpuštěna
v kyselině chlorovodíkové).
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: Erlenmayerova baňka, titrační baňka, byreta, pipeta, stojan.
Chemikálie a materiál: kyselina L-askorbová (celaskon), sodná sůl 2,6-dichlorfenolindofenolu.
Pracovní postup
Do Erlenmayerovy baňky napipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové (celaskon). Titrujte
odměrným činidlem – modrým roztokem sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zbarvení
(Obrázek 16), titraci proveďte 3x a vypočítejte průměrnou spotřebu.
Vyhodnocení
Dle vzorce vypočítejte koncentraci kyseliny L-askorbové a hodnoty zaznamenejte do tabulky 5.
L-askorbová kyselina (mg/l) = Mr . Cčinidlo . Včinidlo / Vtitrovaný
Mr – relativní molekulová hmotnost kyseliny L-askorbové (176,1 g/mol)
Včinidlo – objem 2,6-dichlorfenolindofenolu potřebný pro titraci vzorku v ml
Vtitrovaný – objem kyseliny L-askorbové, který byl titrován v ml
Tabulka 5:
Průměrná spotřeba činidla v ml (ze tří titrací)
mg/l kyseliny L-askorbové
mmol/l kyseliny L-askorbové
Obrázek 16. Průběh stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové. (A) Sestavená titrační aparatura
obsahující stojan, svorky, byretu naplněnou titračním roztokem a titrační baňku. (B) Titrační činidlo
sodná sůl 2,6- dichlorfenolindofenolu poskytující modře zbarvený roztok. (C) Roztok celaskonu
(kyselina L-askorbová) v titrační baňce před přídavkem 2,6- dichlorfenolindofenolu. (D) Roztok
celaskonu po přídavku titračního činidla – ekvivalenční bod – růžové zbarvení roztoku.
3.2.4 Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: Erlenmayerova baňka, titrační baňka, byreta, pipeta.
Chemikálie a materiál: pomerančový džus od různých výrobců, sodná sůl 2,6-dichlorfenolindofenolu.
Pracovní postup
Do Erlenmayerovy baňky odpipetujte 2 ml ovocné šťávy (10x zředěné destilovanou vodou) a titrujte
odměrným činidlem - roztokem sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zbarvení –
ekvivalenční bod.
Vyhodnocení
Ze spotřeby odměrného činidla vypočítejte koncentraci vitamínu C ve zředěné pomerančové šťávě
(mg/l). Výsledek vynásobte 10x (ředění) a zapište do tabulky 6. Výsledek zkuste porovnat s údaji
poskytnutými různými výrobci na obalech (Tabulka 7).
Tabulka 6:
Spotřeba odměrného činidla (ml)
Koncentrace kyseliny L-askorbové ve zředěné šťávě (mg/ml)
Koncentrace kyseliny L-askorbové v původní šťávě (mg/ml)
Údaj výrobce (mg/ml)
Tabulka 7:
Výrobce
Relax 100% jablko fresh juice
Hello 100% pomeranč
Zelený čaj
Černý čaj
Červené víno
Koncentrace vitamínu C
30 mg na 100 ml
40 mg na 100 ml
158 mg na 100 ml
102 mg na 100 ml
220 mg na 100 ml
4. Enzymy v potravinách
Enzymy jsou velmi citlivé živiny, které zodpovídají za provádění prakticky všech metabolických funkcí.
V našem těle máme kolem 3 000 unikátních enzymů, které se podílí na více než 7 000 enzymatických
reakcích. Enzymy jsou potřebné pro všechny chemické reakce, které se uskutečňují v lidském těle.
Žádné minerály, vitamíny ani hormony nevykonají práci bez enzymů. Naše těla, všechny naše orgány,
tkáně a buňky fungují díky enzymům. Bez enzymů bychom tedy přestali fungovat.
Bohužel průměrná strava je téměř zcela bez účinných enzymů. Zpracované a vařená jídla
často zcela zničilo obsah enzymů. Máme-li jakékoli zdravotní potíže, měli bychom používat více
enzymů ve stravě, resp. v ovoci a zelenině jako je ananas obsahující bromelain, papája obsahující
papain, včelí pyl nebo fermentovaná zelenina jako kysané zelí. Mezi ostatní na enzymy bohaté
potraviny patří melouny, mango, kiwi, hroznové víno, avokádo, syrový (nepasterizovaný) med, kefír,
listová zelenina, syrové ovocné a zeleninové šťávy a kokosová voda. Strava bohatá na enzymy dá
vašemu tělu energii, posílí imunitní systém a léčebné procesy těla.
4.1 Stanovení proteasové aktivity v ovoci a zelenině
Teoretický úvod
Proteasy (proteinasy) představují skupinu enzymů, které štěpí proteiny (bílkoviny) na peptidy
a oligopeptidy na aminokyseliny. Patří do třídy hydrolas, hydrolyzují tedy peptidové vazby
aminokyselin, pomocí kterých aminokyseliny drží pohromadě. Termodynamická rovnováha je
posunuta ve směru rozkladu peptidové vazby, enzymy, které tento rozklad katalyzují, nepotřebují
dodávku energie. Vzhledem k množství různých typů proteinů s odlišnými fyzikálně-chemickými
vlastnostmi existuje řada různých typů enzymů, které jsou schopné je štěpit. Budeme se zabývat
zejména enzymy, které dokážou štěpit centrální oblasti proteinů. Takové enzymy se nazývají
proteinasy. Naproti tomu existuje skupina enzymů odštěpujících koncové aminokyseliny, tzv.
exopeptidasy.
Proteinasy lze roztřídit podle celé řady kritérií. Chemická povaha aktivního místa a substrát, na
který enzym přednostně působí, nám poskytují i náhled na mechanismus jeho účinku. V Tabulce 8 je
uveden základní přehled proteinas. Na základě biochemických mechanismů rozlišujeme čtyři základní
typy katalytické aktivity. Ty tvoří serinové, metalo-, cysteinové a aspartátové proteinasy. Serinové
proteinasy a metaloproteinasy jsou nejvíce aktivní v rozmezí pH 7,0 - 9,0 a hrají hlavní úlohu při
degradaci extracelulárních proteinů. Na druhé straně aspartátové a cysteinové proteinasy mají kyselé
pH optimum a podílejí se zejména na degradaci intracelulárních proteinů uvnitř lysosomů, kde je
dostatečně kyselé prostředí.
Tabulka 8. Příklady vybraných proteinas.
Mechanismus
Serinové proteinasy
Aktivní místo
Ser, His, Asp
Metaloproteinasy
Zn koordinačně
vázaný na
aminokyseliny
Cys, His
3,0 – 6,0
2 zbytky Asp
2,0 – 5,0
Cysteinové
proteinasy
Aspartátové
proteinasy
2+
pH optimum
7,0 – 9,0
3,0 – 6,0
Příklady
Trypsin,
chymotrypsin
thrombin,
koagulační faktory
Metaloelastasa
(MMP-12)
Katepsin S, L, B, H
Papain
Bromelain
Ficin
Pepsin
Renin
Serinové proteinasy tvoří největší skupinu savčích proteinas. Jejich aktivita závisí na katalytické
triádě His57, Asp102, Ser195 (čísla udávají polohu aminokyseliny od N-konce, jak se vyskytují
v chymotrypsinu). Jednotlivé aminokyseliny jsou od sebe v sekvenci dost vzdáleny, ale při vytváření
trojrozměrné struktury enzymu se původní "tkanička" proteinového řetězce poskládá takovým
způsobem, aby aminokyseliny tvořící aktivní místo zaujímaly v prostoru potřebné postavení. Většina
serinových proteinas je syntetizována jako inaktivní prekursory (zymogeny), které potřebují k aktivaci
omezenou proteolýzu. Výjimku představují lidská leukocytová elastasa, katepsin G, a proteinasa 3,
které jsou skladovány v aktivní formě v granulích leukocytů. Všechny tyto tři enzymy mají význam
v řadě patologických stavů u člověka.
Chymotrypsin (EC 3.4.21.4) katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb, v nichž je karboxylová
skupina poskytována aromatickými aminokyselinami (fenylalanin, tyrosin, tryptofan) či
aminokyselinami s velkým nepolárním zbytkem (např. methionin). Podobně jako řada dalších
proteinas, katalyzuje hydrolýzu některých esterů. Má tedy esterasovou aktivitu. Z fyziologického
hlediska nemá tato aktivita význam. Co se týče struktury, chymotrypsin sestává ze tří
polypeptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Nachází se v inaktivní formě jako
chymotrypsinogen, který je aktivován působením trypsinu. Chymotrypsin ve své struktuře obsahuje
vysoce reaktivní serin 195 (číslo udává pořadí aminokyseliny v aminokyselinovém řetězci), který je
inaktivován po vazbě diisopropylfosfofluoridu jako jediný z 27 serinových zbytků ve struktuře.
Trypsin (EC 3.4.21.4) katalyzuje hydrolýzu vazby –Lys- (lysin)-X-Arg (arginin), kde X je libovolná
aminokyselina (nesmí po nich následovat prolin). V pankreatické šťávě se nachází v inaktivní formě
trypsinogenu, který je aktivován v tenkém střevě enteropeptidasou (enterokinasou). Vytvořený
trypsin vlivem této peptidasy pak aktivuje další molekuly trypsinogenu i jiné zymogeny. Samotná
aktivace spočívá v odštěpení hexapeptidu o sekvenci Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Existuje řada
inhibitorů schopných trypsin účinně inhibovat. Samotná pankreatická šťáva obsahuje trypsinový
inhibitor. Další známý inhibitor je glykoprotein z vaječného bílku ovomukoid, který se váže na trypsin
v poměru 1:1.
Další významnou serinovou proteinasou je thrombin neboli koagulační faktor II a. Jeho funkcí
je odštěpení fibrinopeptidů z fibrinogenu, posledního stupně kaskády hemokoagulace. Je homologní
s trávícími enzymy trypsinem, chymotrypsinem
a elastasou. Vzniká rozštěpením
molekuly prothrombinu (faktor II) aktivovaným faktorem X; tato reakce je významně urychlována
aktivovaným faktorem V a přítomností fosfolipidů. Zatímco prothrombin je tvořen 582
aminokyselinovými zbytky, aktivní thrombin obsahuje pouze 259 zbytků. Syntéza prothrombinu je,
závislá na vitaminu K, který se podílí na posttranslační karboxylaci postranních řetězců zbytků
kyseliny glutamové (vzniká γ-karboxyglutamyl).
Metaloproteinasy působí zejména na extracelulární matrix (matrix metaloproteinases, MMP)
a vyžadují k plné aktivaci navázané ionty Zn2+ a stimulaci ionty Ca2+ z vnějšku. Souhrnně mohou MMP
degradovat všechny komponenty extracelulární matrix. Intersticiální kolagenasy představují nejvíce
substrát-specifickou skupinu enzymů. Jejich katalytická aktivita účinkuje zejména na skupinu
nativních helikálních kolagenů (typu I, II, III, a X) a rovněž degradují proteoglykany. Želatinasy s širší
proteolytickou aktivitou dále degradují želatiny (kolageny denaturované intersticiálními
kolagenasami) a také degradují kolageny typu IV, V, VII, X a XI, elastin, a komponenty bazální
membrány.
Cysteinové proteinasy (rovněž thiolové proteinasy) mají společný katalytický mechanismus,
dvojdoménovou globulární strukturu a podobnou velikost (23-27 kDa). Do papainové nadrodiny
cysteinových proteinas patří čtyři lidské lysosomální proteinasy (katepsiny B, H, L, S). Všechny čtyři
jsou syntetizovány jako proenzymy, které jsou aktivovány omezenou proteolýzou na aktivní formy,
které se nacházejí v lysosomech. Lysosomální cysteinové proteinasy jsou uzpůsobeny k fungování
v kyselém (pH 5,0 - 6,5) a redukujícím prostředí lysosomů. Významnou skupinu cysteinových
proteinas představují kaspasy. Všechny kaspasy se syntetizují jako neaktivní prekursory, které jsou
lokalizovány v cytoplasmě buněk. Jejich hlavní úloha je při apoptose, programované buněčné smrti.
Proces aktivace je zahajován kaspasou-8, která potom spouští celou kaskádu vzájemných aktivací
dalších kaspas. Výsledkem činnosti kaspas je destrukce celé řady intracelulárních proteinů, což
představuje ireversibilní fázi apoptosy.
V potravinářském průmyslu je využívána řada rostlinných cysteinových proteinas, zejména
papain (EC 3.4.22.2), chymopapain (EC 3.4.22.6), ficin (EC 3.4.22.3) a bromelain (EC 3.4.22.4). Papain
se získává z rostliny papaya (Carica papaya, Vasconcellea cundinamarcensis) a z některých dalších
plodů frakcionováním, odstřeďováním a ultrafiltrací. Výnos je asi 100 g papainu ze stromu za rok. Čím
je papája zralejší, tím obsahuje méně enzymu papainu. Mléko z rostliny papaya a její zelené plody
obsahují dva proteolytické enzymy - papain a chymopapain. Chymopapainu je v nich nejvíce, ale
papain je dvojnásobně účinnější. Je syntetizován ve formě neaktivního zymogenu, který je aktivován
odštěpením N-terminálního propeptidu. Tento propeptid je důležitý pro správné složení nově
syntetizovaného enzymu, inaktivaci peptidasové domény a stabilizaci enzymu vůči denaturaci
v neutrálním a alkalickém pH. Struktura papainu byla vyřešena v roce 1970 Ronaldem F. J.
Mitchelem. Prekursorový protein papainu obsahuje 345 aminokyselin, z toho tvoří zbytky 1-18
signální sekvenci, 19-133 propeptid, 134-345 plně funkční peptid. Struktura obsahuje celkem sedm
cysteinových zbytků, z nichž je pouze jeden volný a ostatní tvoří disulfidické můstky. Právě volná
sulfhydrylová skupina cysteinu Cys25 slouží jako vazebné místo substrátu v aktivním centru enzymu.
Chemická modifikace této sulfhydrylové skupiny způsobuje ztrátu peptidasové aktivity papainu.
Struktura papainu je mimořádně stabilní, odolává denaturaci 8M močovinou a 70% ethanolem.
Teplotní optimum se pohybuje v rozmezí 60-70°C. Hydrolyticky štěpí peptidy, amidy i estery.
V peptidovém řetězci nejlépe štěpí druhou peptidovou vazbu následující směrem k tzv. C-konci za
zbytkem fenylalaninu. V imunologii se využívá jeho schopnosti odštěpit Fc fragment imunoglobulinů
(krystalizující část, nožičky těžkého řetězce) od Fab části (antigen-vázající, raménka lehkého řetězce),
a to v místě závěsu (přechod ramének v nožičku, v tomto místě je molekula velmi pohyblivá). Papain
se nachází v přirozeně vysoké koncentraci v zelené slupce a v jádrech ovocného plodu. Má rovněž
mírné, uklidňující účinky na žaludek a napomáhá trávení proteinů. Dále se používá k tenderizování
"rozrušení" masa, v medicínských přípravcích díky jeho protizánětlivým vlastnostem a v doplňcích
stravy jako součást tablet napomáhajících trávení. V lékařství se používá při léčení ekzémů a nekros neprogramovaná (patologická) smrt buňky, ke které dochází v důsledku nevratného narušení některé
ze základních buněčných funkcí. Tento enzym má i řadu dalších použití, například v kuchyni se
používá ke zjemnění rybího masa, při vaření piva zamezuje zkalení piva. V textilní technice se používá
jako pomůcka k výrobě vlny a hedvábí, aby se zamezilo jejich zplstnatění a scvrknutí.
Jako bromelain (bromelin) je označován extrakt proteolytických enzymů (EC 3.4.22.32 a EC
3.4.22.33) společně s dalšími složkami obsaženými v čerstvém ananasu. Pro izolaci bromelainu pro
komerční využití se využívá zejména stonek, avšak i plody jsou jeho významným zdrojem. Bromelain
má silně protizánětlivé vlastnosti, čehož se využívá při léčbě bolestí, otoků a hojení tkání. Také
zabraňuje srážení krevních destiček, což je prospěšné při prevenci srdečních chorob, protože snižuje
riziko vzniku trombóz. pH optimum se pohybuje v rozmezí 4,5-5,5 a teplotní optimum v rozmezí
teplot 50-60°C. V kulinářství má využití ke změkčování (tenderizaci) masa, kdy se k masu přidává
v práškové formě společně s marinádou nebo se přímo nasype do tepelně neupraveného masa.
Vařením či konzervací ztrácí bromelain svoji aktivitu.
Významným zástupcem z rodiny aspartátových proteinas je pepsin A (EC 3.4.23.1). Katalyzuje
hydrolýzu vazeb Glu (glutamová kyselina) - Leu (leucin) - Tyr (tyrosin) - Phe (fenylalanin). Je
produkován buňkami žaludeční sliznice, a to ve formě inaktivního pepsinogenu. Ten se aktivuje na
pepsin katalyticky protonem. Vlivem iontu H+, při pH 1,5 - 2,5 a již aktivních molekul pepsinu, se
z molekul pepsinogenu odštěpuje více peptidu, přičemž se uvolní katalyticky aktivní centrum.
Odštěpený peptid (inhibiční peptid) se může při slabě kyselém, resp. neutrálním pH vázat s pepsinem
a intenzivně snižovat jeho aktivitu. Při kyselém pH (menším než 4,5) se inhibiční peptid z pepsinu
odštěpí. Pro účinek pepsinu je tudíž potřebná dostatečná sekrece kyseliny chlorovodíkové. Během
sekrece žaludeční šťávy se malé množství pepsinogenu přepravuje z hlavních buněk do krevní plazmy
a močí se vylučuje jako uropepsinogen. Vylučování uropepsinogenu roste při poškození žaludeční
sliznice.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: Petriho miska, nůž, kádinky, vařič, párátko.
Chemikálie a materiál: jablko, citron, kiwi, čerstvý ananas, želatina, šunkový salám, salám Vysočina.
Pracovní postup
Kolečka salámu položte na Petriho misku a na něj položte plátek citronu, jablka, kiwi či ananasu.
Ponechejte 1 den a poté pozorujte strukturu salámu pod jednotlivými druhy ovoce. Vyzkoušejte, jak
silnou stopu zanechá škrábnutí párátkem na místech salámu pod ovocem. Dále připravte asi 150 ml
želatiny a nalijte ji do tří kádinek a nechejte ztuhnout. Na každou z kádinek položte plátek ovoce a
nechte půl dne působit. Pozorujte strukturu želatiny pod jednotlivými druhy ovoce (Obrázek 17).
Vyhodnocení
Kiwi a ananas obsahují velké množství proteinas. Ty štěpí bílkoviny přítomné v mase nebo želatině na
kratší řetězce. Po působení enzymu můžeme pozorovat „rozbřednutí“ bílkovinné hmoty – želatina se
roztéká.
Obrázek 17. Proteasová aktivita v ovoci. (A) Kolečka salámu a ztuhlá želatina připravena k pokusu
v Petriho miskách. (B) Pořadí vzorků: banán, nektarinka, jablko, kiwi a mrkev – 1. den. (C) Tytéž
vzorky již po 24 hodinové inkubaci při 25°C – 2. den. (D) Struktura želatiny/salámu pod jednotlivými
vzorky.
4.2 Katalasa v potravinách
Teoretický úvod
Katalasa (EC 1.11.1.6, KAT) je enzym ze třídy oxidoreduktas fungující jako katalyzátor rozkladu dvou
molekul toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík: 2 H2O2 → 2 H2O + O2. Peroxid vodíku je vedlejší
produkt metabolických procesů buňky. Kataláza je enzym schopný kromě redukce, i oxidace peroxidu
vodíku, čímž se podstatně liší od peroxidas (EC 1.11.1.5), které dovedou H2O2 pouze redukovat za
současné oxidace sekundárního substrátu, kterým mohou být (pro buňky toxické) objemnější
molekuly fenolických sloučenin. Katalasy a peroxidasy představují esenciální výbavu buněk při
překonávání škodlivých účinků oxidačního stresu – brání membrány před oxidativním poškozením.
Katalasa je přítomna u téměř všech organismů s aerobním metabolismem, tedy v živočišných
orgánech (zejména v erytrocytech a v peroxisomech jaterních buněk), v rostlinných pletivech a
aerobních mikroorganismech. V buňkách eukaryot je katalasa typickým markerem subcelulárních
organel, známých jako peroxisomy, které obsahují anabolické systémy, jako například mechanismus
β-oxidace mastných kyselin. Její hlavní fyziologická role tkví v ochraně buněk před mimořádně
reaktivními molekulami s peroxidickou vazbou, které vznikají jako vedlejší produkty katabolismu.
Její prosthetickou skupinou je hem – obsahuje čtyři porfyrinové hemové (železnaté) skupiny. Katalasa
je mimořádně katalyticky účinná; jedna molekula enzymu může za minutu přeměnit 5 milionů
molekul peroxidu vodíku.
Cílem úlohy je porovnat vybrané potraviny (ovoce, zelenina) z hlediska obsahu enzymu
katalasy rozkládající peroxid vodíku a identifikovat plyn, který tímto rozkladem vzniká.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: zkumavky ve stojánku, nůž, kádinka, prkénko, zápalky, špejle
Chemikálie a materiál: 10% roztok peroxidu vodíku, ovoce (kiwi, citron, jablko), zelenina (brambora,
cibule, mrkev), droždí (sušené nebo čerstvé), sacharosa
Pracovní postup
V menší kádince připravte 20 ml 10% vlažného roztoku sacharosy. Poté do roztoku sacharosy
vsypejte asi čtvrt lžičky droždí a nechejte 10 min vzejít. Do 7 zkumavek ve stojánku nalejte vždy 5 ml
10% roztoku peroxidu vodíku. Z uvedeného ovoce odkrojte vždy stejně velký kousek (dle velikosti
použitých zkumavek). Do prvních 6 zkumavek vhoďte kousek ovoce/zeleniny a do sedmé zkumavky
nalejte asi 2 ml připravené suspenze droždí (v sacharose).
Po 2-5 minutách pozorujte a popište intenzitu reakcí v jednotlivých zkumavkách, poté vsuňte do
zkumavek doutnající špejli a pozorujte její chování, které zapište do tabulky 9.
Vyhodnocení
Vyhodnoťte, která z vybraných surovin má nejvyšší obsah katalasy dle intenzity rozkladu H2O2. Při
reakci se uvolňuje kyslík, který lze identifikovat doutnající špejlí – kyslík podporuje hoření – špejle nad
hladinou zkumavky jasně vzplane.
Nejintenzivnější rozklad probíhá v droždí, poté v bramborách nebo kiwi. Katalasa se však hojně
vyskytuje i v syrových kuřecích játrech nebo jiné prokrvené tkáni (krev při styku s H2O2 jako
dezinfekčním činidlem „bublá“). Jaké jsou další zdroje katalasy?
Tabulka 9. Tabulka pro záznam pozorování intenzity vzniku bublinek.
Surovina
kiwi
jablko
citron
mrkev
brambora
Intenzita
rozkladu
cibule
droždí
5. Nukleové kyseliny
5.1 Analýza a detekce DNA a RNA pomocí agarosové elektroforézy
Teoretický úvod
V současné době se moderní biochemický výzkum neobejde bez základních znalostí molekulární
biologie a metod používaných pro práci s mikroorganismy a nukleovými kyselinami.
Elektroforéza, neboli migrace iontů v elektrickém poli, se velmi často používá pro analytické
dělení biologických látek, hlavně pak proteinů a nukleových kyselin. Elektroforéza většinou probíhá
na vhodném nosiči jako je papír, celulosa nebo polymerní gel. Nejčastějším typem gelové
elektroforézy je agarosová elektroforéza (Obrázek 18), která se používá hlavně na dělení látek
s velkou molekulovou hmotností (DNA, RNA). Aby byla zajištěná dostatečná pohyblivost takto velkých
molekul, musela by se použít velmi nízká koncentrace akrylamidu (pod 3%) a gel by byl velice měkký
a manipulace s ním komplikovaná. Agarosové gely jsou i v nízkých koncentracích velmi pevné
a koncentrace agarosy v nich je závislá na velikosti dělených nukleových kyselin, od 3% pro fragmenty
DNA a RNA mající desítky až stovky párů bází po 0.8% pro fragmenty velikostí tisíců až desetitisíců
párů nukleotidových bází.
Obrázek 18. Princip agarosové elektroforézy
(převzato z http://mmp.vfu.cz/opvk2011/?title=popis_metod-gelova_elektroforeza).
Chemicky je agarosa polysacharid skládající se z D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy (Obrázek 19),
který se izoluje z červených řas – ruduch. Je teoreticky zcela nenabitá, nicméně může obsahovat
příměsi nabitých sulfátových či pyruvátových skupin. Agarosa našla celou řadu praktických uplatnění
v laboratorní praxi, vytváří síťovitý materiál, v němž může být realizována elektroforéza, imunodifuze,
gelová filtrace či afinitní chromatografie.
Obrázek 19. Podjednotka agarosy.
Nejčastější uspořádaní agarosové elektroforézy je horizontální, přičemž princip dělení je na rozdíl od
proteinů vždy závislý pouze na velikosti nukleové kyseliny, která je sama o sobě negativně nabitá
a pohybuje se proto směrem od katody (-) k anodě (+). DNA fragmenty se pohybují v agarosovém
gelu vlivem působení stejnosměrného elektrického pole. Dělení fragmentů je závislé na jejich
velikosti; větší fragmenty se pohybují pomaleji, menší rychleji. Koncentrace agarosového gelu určuje
velikost pórů; DNA fragmenty určité velikosti se pohybují agarosovými gely o různé koncentraci různě
rychle. Existuje lineární korelace mezi ´log´ pohyblivosti (mobility) a koncentrací gelu pro určitý
rozsah velikostí dělených fragmentů. To znamená, že koncentrace gelu musí být volena v závislosti na
velikosti separovaných DNA fragmentů. Závislost ´log´ molekulové váhy známých markerů a jejich
mobility umožňuje sestavit kalibrační křivku a určit molekulovou váhu neznámých fragmentů.
DNA však není v agarosovém ani polyakrylamidovém gelu možno vidět. Je proto nutné ji nějakým
způsobem obarvit nebo označit. Nejpoužívanějším barvivem pro DNA jsou planární aromatické
kationty, jako je např. ethidium bromid, akridinová oranž nebo SybrGreen, které se interkalují
(vmezeří) do struktury dvoušroubovice (fluorescenční barviva) a po ozáření UV světlem následně
fluoreskují (pomocí transluminátoru, λ = 300 nm).
Gelová elektroforéza je často využívána ke stanovení čistoty a stupně degradace izolované DNA. RNA
kontaminující vzorky DNA se projevuje šmouhou o nízké molekulové váze. Rozdělené molekuly DNA
lze také ve funkční formě izolovat z gelu.
Experimentální vybavení
Laboratorní pomůcky: mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), horizontální elektroforetická komůrka
SafeBlue se zdrojem napětí (Obrázek 20), systém pro digitální fotodokumentaci gelů, mikropipety,
špičky, parafilm
Chemikálie a materiál: 1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA),
0,125 % bromfenolová modř (nanášecí barvička), 1 kb DNA marker
Obrázek 20. SafeBlue horizontální elektroforetická komůrka se zdrojem napětí využívající Blue LED
světlo pro okamžitou vizualizaci DNA/RNA bandů během průběhu agarosové elektroforézy.
Pracovní postup
Pod dohledem vyučujícího si sestavíme elektroforetickou komůrku pro agarosový gel v horizontálním
uspořádání. Po celou dobu pracujeme v nitrilových rukavicích. Připravíme si 1% agarosu v 1x TAE
pufru (1 g práškové agarosy na 100 ml 1x TAE) a rozpustíme v mikrovlnné troubě (případně nad
kahanem či na plotně magnetického míchadla). Připravenou agarosu poté po mírném zchladnutí (na
cca 60°C) nalijeme do elektroforetické komůrky do výšky asi 1 cm. Agarosa se nalévá do prostoru
ohraničeného postranními plastovými deskami (gumičkami) na nosnou skleněnou desku. Ihned
přidáme na 100 ml agarosy 8 μl GelRed barviva (firma Biotinum) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm
od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak, aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky
gelu (pozor na tvorbu bublinek). Gel ponecháme tuhnout asi 30 minut.
Po 30 minutách odstraníme postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 500 ml
elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým gelem a nakonec pod hladinou
odstraníme opatrně hřeben.
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky DNA a RNA, které jsme izolovali bud pomocí komerčního
kitu, fenol-chloroformovou extrakcí nebo pomocí pouhé lýze buněk. Na připravený proužek
parafilmu (lze smíchat i v mikrozkumavkách a poté stočit v pikofuze) pipetujeme 10 μl izolované DNA
či RNA a přidáme pětinu objemu denaturačního barviva (nanášecí barvičky obsahující bromfenolovou
modř) a promícháme špičkou.
Jednotlivé vzorky nanášíme opatrně pipetou do jamek v gelu vytvořených hřebínkem na startu
elektroforézy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém
pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu jednotlivých vzorků. Do první a
poslední jamky naneseme 5 μl DNA 1 kb markeru jako standard molekulových hmotností
DNA/případně RNA markeru.
Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem a nastavíme na zdroji napětí 120 V po
dobu asi 30-40 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.
Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme
snímek digitální kamerou připojenou k UV-transluminátoru podle pokynů vedoucího cvičení.
Vyhodnocení
Pořízený snímek včetně DNA či RNA markeru popíšeme a vyhodnotíme.
Na obrázku 21 lze vidět elektroforézu intaktní RNA, kdy lze vidět dva jasné bandy 18S a 28S rRNA
značící kvalitní RNA. V případě již degradované RNA bychom pozorovali vznik mnoha fragmentů o
různých velikostech.
Obrázek 21. Agarosová elektroforéza RNA v 1% gelu.
6. Testové otázky
Číslo úlohy:
1
Název úlohy:
Proteiny
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Keratin se řadí mezi proteiny s funkcí:
stavební
skladovací
ochrannou
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Terciární strukturu keratinu jako skleroproteinu zajišťují:
Disulfidické můstky
Vodíkové vazby
Kovalentní vazby
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
V jakém průmyslu a k čemu se využívá hydrolyzovaný keratin?
V kosmetickém průmyslu do masek, šamponů a kondicionérů
Jako zpěňovací přísada do hasicích přístrojů
V masném průmyslu jako odpad ze srsti a kopyt k zahušťování
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Kolik karboxylových skupin ve své molekule obsahuje kyselina glutamová?
dvě
jednu
tři
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
V potravinářském průmyslu se kyselina glutamová označuje kódem:
E620
E334
E220
Otázka:
Kolik g na kg či litr kyseliny glutamové umožňuje používat česká legislativa
v potravinách?
10
2
0,5
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Číslo úlohy:
2
Název úlohy:
Sacharidy
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Z kterých dvou polysacharidů se skládá škrob?
Amylosa a amylopektin
Amylosa a glykogen
Amylopektin a glukoamylasa
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Amylopektin poskytuje s jodem:
Červenofialovou reakci
Červenohnědou reakci
Modrou reakci
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
50% produkce škrobu se využije v průmyslu:
Potravinářském
Papírenském
Oděvním
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Která z uvedených plodin obsahuje nejvyšší obsah škrobu ve škrobových
zrnech?
kukuřice
rýže
brambory
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
V které části buňky se tvoří škrobová zrna?
amyloplasty
chromoplasty
vakuoly
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Která teplota se udává jako počáteční teplota mazovatění škrobových zrn?
60°C
37°C
90°C
Číslo úlohy:
3
Název úlohy:
Stanovení a důkazy vitamínů
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Kolik existuje základních typů vitamínů?
13
10
20
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Mezi vitamíny rozpustné v tucích se řadí:
tokoferol
biotin
riboflavin
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Mezi vitamíny rozpustné ve vodě se řadí:
Kyselina askorbová
retinol
Vitamín E
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Mezi vitamíny rozpustné v tucích se řadí:
Vitamín K
Kyselina listová
Kyselina nikotinová
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Který z vitamínů způsobuje při jeho nedostatku křivici, odvápňování
a měknutí kostí?
kalciferol
tokoferol
riboflavin
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Který z vitamínů je klíčový pro krvetvorbu?
Kobalamin (B12)
Pyridoxin (B6)
Riboflavin (B2)
Číslo úlohy:
4
Název úlohy:
Enzymy v potravinách
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Proteasy se řadí do třídy enzymů:
hydrolasy
lyasy
transferasy
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Serinové proteasy mají pH optimum ve škále:
7,0-9,0
2,0-5,0
3,0-6,0
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Které ionty ke své plné aktivaci a stimulaci potřebují metaloproteinasy?
Zn2+, Ca2+
Cu2+, Ca2+
Zn2+, Fe2+
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Bromelain jako extrakt proteolytických enzymů se nachází v které plodině?
ananas
brokolice
papája
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Katalasa katalyzuje rozklad dvou molekul:
Peroxidu vodíku
Vody
Kyslíku
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Katalasa se využívá jako marker které buněčné organely?
peroxisomy
vakuoly
plastidy
Číslo úlohy:
5
Název úlohy:
Nukleové kyseliny
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Při elektroforéze migrují ionty v:
Elektrickém poli
Magnetickém poli
Stacionárním magnetickém poli
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Agarosa je polysacharid skládající se z:
D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy
L-galaktosy a glukosaminu
L-galaktopyranosy a agaropektinu
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Nukleová kyselina je sama o sobě nabitá:
Negativně
Kladně
Neutrálně
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Lze DNA/RNA v agarosovém gelu vidět?
Ne
Ano
Otázka:
Správná odpověď:
Chybná odpověď:
Chybná odpověď:
Které toxické barvivo se nejčastěji používá pro barvení DNA/RNA?
Ethidium bromid
GelRed
SybrGreen