přednáška ke stažení v pdf - Oblastní nemocnice Příbram

Využití polymerázové řetězové
reakce (PCR) v klinické
mikrobiologii
Mgr. Tereza Vavrochová
Oblastní nemocnice Příbram, a.s.
Oddělení mikrobiologie a parazitologie
Dr. Karry Mullis
1983, Cetus Corporation
PCR – Polymerase Chain
Reaction
• nested PCR
• multiplex PCR
• qPCR
• iPCR
• RT-PCR
• ……………..
• real-time PCR
http://en.wikipedia.org/wiki
/File:Kary_Mullis.jpg
Princip PCR
http://users.ugent.be/~avierstr/principles
/pcr.html
• nárůst koncentrace amplifikačního produktu v průběhu PCR je
měřen pomocí fluorescenčně značených sond
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
http://www.generi-biotech.com/realtime-pcr-sondy-o-dualne-znacenychsondach/
• detekce fluorescenčního signálu je snímána v real-time PCR
přístroji, tzv. termocykleru
http://www.imogena.pl/en/equipment/real-time-pcrthermocyclers/slan-1/
http://www.abbottmolecular.com/us/technologies/real-timepcr/maxratio-data-analysis.html
Výhody PCR
Přímá diagnostika
• detekce cizorodé DNA
Rychlost
• diagnostika špatně kutlivovatelných mikroorganismů (mykobaktérie,
mykoplasmata, většina virů….)
Specifita
• minimalizace falešně pozitivních a falešně negativních výsledků
Citlivost
• jednotky kopií genomu daného agens na PCR reakci
Zjištění infekce z širokého spektra vzorků
• tělní tekutiny, tkáně, katétry…..
Limity PCR
Citlivost
• zvýšené riziko kontaminace při odběru klinického materiálu
• možnost přetrvávání mrtvých mikroorganismů po infekci
v některých klinických materiálech (stěry ze sliznic, výtěry pochvy, biopsie
kůže, likvor)
• možnost detekce latentní infekce
Nelze vyšetřit ATB rezistence
Neznalost reálného přínosu metody
Přehnaná očekávání
Seznam prováděných vyšetření
• Chlamydia pneumoniae
• Mycobacterium tuberculosis komplex
• Legionella pneumophila
• Mycoplasma pneumoniae
• Chlamydia trachomatis
• Borrelia burgdorferi sensu lato
• Cytomegalovirus
• Neisseria gonorrhoeae
• Epstein-Barr Virus
• Herpes Simplex Virus 1 a 2
• Varicella-Zoster Virus
• Hepatitis B Virus
Cena PCR vs. serologické vyšetření
Serologie (Kč)
PCR (Kč)
ELISA
WB
Chlamydia pneumoniae
1208,48
X
3774,40
Chlamydia trachomatis
1208,48
X
3774,40
Mycoplasma pneumoniae
1208,48
1106,60
X
Borrelia burgdorferi sensu lato
1208,48
1106,60
3756,48
Cytomegalovirus
1208,48
1106,60
3756,48
Epstein-Barr Virus
1208,48
2504,30
3756,48
Herpes Simplex Virus 1 a 2
1208,48
X
3774,40
Zásady odběru vzorků
• Dbát na maximální sterilitu, aby se zamezilo možné kontaminaci při
odběru.
• Odebírat takové vzorky, v nichž se patogen v předpokládané fázi
onemocnění může vyskytovat!
• Používat výhradně beztalkové rukavice! Talek inhibuje PCR reakci.
• Zásadně neodebírat vzorky do transportního media! Nepoužívat fixaci!
• Odebírat výhradně nesrážlivou periferní krev do antikoagulantu EDTA!
• Všechny typy vzorků kromě krve transportovat do 12 hodin při 4°C do
laboratoře; nesrážlivou krev transportovat do 24 hodin při 4°C.
www.nemocnicepribram/pcr
Shrnutí
„Tradiční“ mikrobiologické diagnostické metody mají v některých
případech omezení v nízké senzitivitě, snížené schopnosti detekovat
špatně kultivovatelné nebo nekultivovatelné mikroorganismy, apod. Tyto
limity jsou překonatelné právě s pomocí molekulární mikrobiologické
diagnostiky, která je kultivačně nezávislá, vyniká rychlostí, specifitou a
vysokou ciltivostí.
Nejasné nebo podezřelé nálezy je vhodné ověřit opakovaným
vyšetřením a porovnat s výsledky z jiných laboratorních metod,
především se stanovením specifických protilátek a nespecifických
markerů infekce (prokalcitonin, CRP, CD23,..). Konečná interpretace je
poté vždy prováděna v souvislosti s klinickým stavem pacienta.
Negativní výsledek nevylučuje možnost infekce!
Děkuji za pozornost