Inkluzní tělíska - Škola molekulárních biotechnologií Profession

ŠKOLA MOLEKULÁRNÍCH BIOTECHNOLOGIÍ
PROFESSION
Studijní texty k teoretickým modulům
Olomouc 2010
Kolektiv autorů:
Prof.
MUDr.
Evţen
Weigl,
CSc.;
Doc.
MUDr.
Milan
Raška,
Ph.D.;
RNDr. Petr Šíma, CSc.; RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.; Bc. Jan Frömmel, RNDr. Leona
Raskova Kafkova, Ph.D.
OBSAH
1. ÚVODNÍ SLOVO
2. MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST
8
10
Úvod do problematiky projektu
Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO)
E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA
10
12
19
Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů
Bakteriální expresní systémy
Kvasinkové expresní systémy
Hmyzí expresní systémy
Savčí expresní systémy
23
25
30
35
37
Výběr genu a jeho izolace
Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Techniky izolace známého genu a cDNA (PCR, RT-PCR, RACE)
Práce s genovými a proteinovými databázemi
Klonovací a expresní plasmidy
Základní technika klonování (restrikce – ligace)
Minipreparace a maxipreparace DNA
Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu.
41
41
42
45
51
52
55
56
57
Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální, rekombinace do genomu
60
Vnesení plasmidů do buněk – transformace
Chemická transformace – principy, příprava kompetentních buněk
Elektroporace – princip, příprava kompetentních buněk, podmínky
60
60
61
Stabilita plasmidů v buňkách
Episomální DNA
Antibiotická selekce
Homologní rekombinace
63
63
63
65
Ověření exprese genů na laboratorní úrovni
Fenotypová analýza, PCR analýza
Skríning produkce rekombinantních proteinů
65
65
66
3. BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
68
Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů
68
Bioreaktor
Klasifikace typů bioreaktorů
Kultivace SSC a SLC
Ideální bioreaktor
Submerzní kultivace v kapalném médiu
Speciální bioreaktory
68
69
70
71
72
72
Míchání bioreaktorů
Pneumatické míchání bioreaktorů
Bioreaktory s fluidním ložem
Mechanicky míchané bioreaktory
Základní typy míchadel
73
73
74
74
76
Přestup tepla
77
Aerace a přestup kyslíku
78
Kultivační půdy – média
79
Příprava inokula
80
Sterilizace u bioreaktorů
Hodnocení sterility
Sterilizace vzduchu a odplynů
80
81
81
Inokulace
81
Základní typy kultivačních procesů
Vsádková kultivace (batch)
Přítokovaná kultivace (fed-batch)
Strategie řízení přítokování
Kontinuální kultivace
82
82
84
84
84
Optimalizace bioprocesu
Optimalizace složení média
Optimalizace kultivačních parametrů
Monitoring a automatizace
85
85
86
86
Kultivace rekombinantních mikroorganismů
Prokaryotní expresní systém – E. coli
Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris
87
87
87
Použité zdroje
88
4. SEPARACE BIOMASY A HRUBÁ IZOLACE CÍLOVÝCH MOLEKUL
89
Separace biomasy od kultivačního média
Ssedimentace
Filtrace
Tangenciální filtrace
Průtoková centrifugace
89
89
89
89
89
Spůsoby dezintegrace biomasy a izolace produktu z ní
Fyzikální metody dezintegrace
Chemické metody dezintegrace
89
89
89
5. METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ
90
Selektivní precipitace
90
Chromatografické metody
Afinitní purifikace
Iontově výměnná chromatografie
Gelová filtrace
91
93
94
95
Hydrofobní chromatografie
Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant
96
98
Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu
Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou
Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu
100
100
100
Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování
101
Metody sušení produktů
Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů
Krystaly makromolekul
Sušení za zvýšené teploty – sušárny, sprejové sušení
Sušení za snížené teploty – evaporační centrifugace, lyofilizace
105
105
105
106
106
Speciální část frakcionace biopolymerů HA
Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů – kyselou hydrolýzou
Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením
106
106
107
6. OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL
Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC
Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod
Parametry mobilní a stacionární fáze
Detekce peptidů a proteinů HPLC
Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie)
Gelová permeační chromatografie (SEC)
Iontově výměnná chromatografie
Hydrofobní interakční chromatografie – HIC
108
108
108
108
109
109
110
110
111
Stanovení molekulových hmotností pomocí SEC-MALS HPLC (size-exclusion chromatography plus multi-angle
light scattering)
111
Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy
Jednorozměrná denaturační elektroforéza
Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek
Dvourozměrná gelová elektroforéza
Izoelektrická fokusace (IEF)
Kapilární elektroforéza
Volná kapilární elektroforéza
112
112
113
113
114
114
114
Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE
115
Flow field flow frakcionace (FFFF)
115
Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering)
Rozptyl světla
Brownův pohyb
Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh)
Princip metody DLS
Vyjádření výsledků distribuce velikosti
Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic
Přístroje pro měření pomocí DLS
Výhody a omezení DLS
Ukázka praktické aplikace
119
119
120
121
122
126
127
127
129
131
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC)
132
7. HORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE
136
Historie
136
Výměna genetické informace
Bakterie
Eukaryota
137
137
138
Vznik imunity jako obrany integrity
140
Genom člověka
141
Pangenom
143
Závěry
144
1. ÚVODNÍ SLOVO
Biotechnologie jako vědní disciplína je arbitrárně vymezený obor, který zahrnuje
široké spektrum odborných aktivit s vyuţitím biologických postupů. Základní
biotechnologické procesy provázejí člověka v téměř celé jeho kulturní historii. Jde
především o postupy jako je kvašení, izolace různých látek z biologického materiálu,
koţeluţství a podobně. Specializovanější biotechnologické postupy se historicky objevují
v době, kdy technický pokrok umoţnil vyuţití biologických principů v řadě
průmyslových odvětví, jako je farmacie, energetika, potravinářství, zemědělství apod.
Formulace termínu biotechnologie je přikládána maďarskému inţenýrovi Karl
Eerekimu, který v roce 1917 pouţil tohoto termínu k popisu procesů, při nichţ se na
tvorbě výsledného produktu podílejí ţivé organismy. Dnes je tato disciplína definována
jako jakákoliv technologie, která vyuţívá biologické systémy, ţivé organismy nebo jejich
části k výrobě nebo přeměně látek, případně jinému specifickému cíli.
Cíle biotechnologických procesů jsou pouze ojediněle ryze humanistické.
Základním motivem je ekonomika – moţnost přinést na trh produkty nedostupné
klasickými cestami, případně zavést procesy, u nichţ je efektivně dosaţeno větší čistoty
nebo většího objemů produktů, případně, s vyuţitím biologických systémů, nových
molekulárních transformací. Ekonomická efektivnost biotechnologií se stala stimulem
pro cílený (aplikovaný) rozvoj základních vědních disciplín orientovaných do
biotechnologických aplikací.
Poznání biochemických procesů v metabolismu rostlin i ţivočichů vedlo k rozvoji
velmi sofistikovaných postupů, při nichţ se klasická průmyslová cesta kombinovala
s biologickými procesy s vyuţitím extraktů nebo izolovaných enzymů. Tyto postupy byly
povaţovány za mimořádný pokrok. Nicméně v posledních dvou aţ třech desetiletích byly
nastartovány molekulárně biologické procesy umoţňující manipulace přímo s genetickou
informací. Jejich převedení do forem pouţitelných v průmyslovém měřítku znamenalo
novu dimenzi biotechnologií - molekulární biotechnologie. Nejde o přesně vymezenou
disciplínu. Postupy zaloţené na manipulaci s genetickou informací mají výstupy do řady
významných oborů průmyslu a biomedicínckých věd. Spektrum moţného vyuţití
molekulárně biotechnologických principů se táhne od bioenergetiky přes farmacii,
zemědělství, potravinářský průmysl aţ po přípravu transgenních savců a klonování
evolučně vyspělých organismů.
Vyuţití molekulární biologie v průmyslové dimenzi je mimořádně náročné na
vědecké zázemí, ale téţ na kvalifikaci pracovníků ve výrobě. Dalším faktorem náročnosti
jsou mimořádné investice nezbytné k průmyslové realizaci biotechnologických postupů.
Vstup do této oblasti je tedy limitován vytvořením dostatečně široké základny pracovních
sil (lidských zdrojů) a ekonomickou úrovní potenciálních investorů.
8
Z tohoto úhlu pohledu nacházíme veliké rozdíly jak mezi jednotlivými státy, tak i
uvnitř těchto států mezi regiony. Oblast molekulárních biotechnologií se tak stává
doménou bohatých nadnárodních společností, zejména farmaceutického zaměření,
některých zemědělských a energetických komplexů a v neposlední řadě bohatých firem
z jiných výsečí průmyslového světa, které hledají budoucnost pro současné kapitálové
přebytky (ocelářské společnosti, tabákové koncerny, naftový průmysl, atd.).
Jak je to s moderními biotechnologiemi na molekulární úrovni v České republice?
S výjimkou několika málo podniků, které jsou derivátem velkých zahraničních koncernů
a mají svůj specifický program s importovaným vývojem, nemá Česká republika příliš
mnoho biotechnologických firem, které by rozvíjely vlastní know-how na úrovni
molekulární biotechnologie. Ke světlým příkladům patří např. firma Contipro Group a.s..
Její odborný představitel Dr. Velebný, CSc. (a současně i spolumajitel) měl jednu
z úvodních přednášek ve výukovém projektu Škola molekulárních biotechnologií –
Profession, v níţ mj. shrnul úskalí tohoto podnikání.
Na základě konzultací
s představiteli některých významných biotechnologických subjektů fungujících na území
ČR vystoupilo do popředí téměř jednotné stanovisko: jejich představitelé nebudou
investovat do moderních biotechnologických procesů na územích, kde je nedostatek
vysoce kvalifikovaného personálu. Teprve přesvědčivý dostatek, eventuelně nadbytek
vysoce kvalifikovaných pracovníků přivede investory na naše území. Tato skutečnost je
jedním z motivů, které vedly k přípravě a realizaci projektu OPVK „Škola molekulárních
biotechnologií-Profession“.
Projekt je finančně podporovaný z fondů EU. Klade si za cíl seznámit
kompetentní uchazeče s teoretickým zázemím a vybranými metodickými přístupy
moderních biotechnologických postupů. Jak název napovídá, projekt je zaměřen do
oblasti molekulárních biotechnologií. Ty dnes představují relativně vymezenou disciplínu
sahající od identifikace a izolace vybrané genové struktury aţ po její realizaci ve
vhodném produkčním systému, ať uţ se jedná o mikroorganismus nebo vyspělý
eukaryontní systém. Biotechnologie na všech úrovních a v oblasti molekulárně
biologické zvlášť, jsou syntetickým oborem vyţadujícím speciální znalosti různých
disciplín. Nejčastěji jsou uváděny: biochemie, mikrobiologie, imunologie, genetika,
molekulární a buněčná biologie, organická chemie a další. Segmenty těchto oborů jsou ve
svém rozsahu i spektru určovány zpravidla konkrétními technologickými postupy a
realizačními výstupy. V tomto ohledu jde tedy o velmi dynamický obor.
Milníkem na cestě rozvoje molekulárních biotechnologií byla práce Cohena at al,
z roku 1973 potvrzující moţnost přenosu funkční DNA z jednoho mikroorganismu do
druhého . Byl tak poloţen základ rekombinantním technologiím. Jejich pionýrské práce
potvrdily reálnost principu genových a buněčných manipulací, případně inţenýrství. Tím
je myšlena příprava nových biologických konstruktů od genové úrovně po
mnohobuněčné systémy. Hranice těchto procesů nejsou zatím stanoveny. Limitem
9
pravděpodobně nebudou ani tak otázky vědecké, jako spíše etické, legislativní, nebo
otázky bezpečnostních rizik. V biotechnologické problematice se více neţ v jiných
oborech promítá současná nerovnováha ve vyspělosti společnosti v kategoriích
vědeckých a vývojových na straně jedné a v otázkách mravních, filozofických,
náboţenských a legislativních na straně druhé. Obory molekulárních biotechnologií a
jejich potenciál jsou v kaţdém případě stimulem pro diskusi v tomto směru.
Jak je uvedeno shora, motorem biotechnologického výzkumu jsou ekonomické
faktory. V komerční sféře je dokonce zrod molekulárních biotechnologií spojován
s burzovním úspěchem firmy Genetech a datem 14. řijna 1980. Toho dne byl zaznamenán
dramatický vzestup ceny akcií této firmy na New Yorkské burze. Vzestup ceny akcie
z 35 dolarů na 89 dolarů byl v té době rekordním vzestupem ceny veřejně
obchodovatelných akcií. Ekonomický úspěch se opíral o novou technologii firmy, která
umoţňovala výrobu dvou řetězců lidského inzulínu rekombinantní cestou
v mikroorganismu Escherichia coli. Tento postup znamenal pro laickou veřejnost
revoluční převrat v dosavadních technologických moţnostech a cestu k naplnění mnoha
vizí lidské společnosti. Není při tom podstatné, ţe některé vize jsou naivní a zatím
nereálné. Motor byl nastartován a ekonomické výsledky byly a jsou inspirativní a
motivující. Není proto překvapením, ţe v průběhu následujících pěti let (do r. 1985) bylo
v USA zaloţeno kolem 400 nových společností orientovaných na genové manipulace.
Současná čísla je obtíţné odhadovat. Je nicméně nesporné, ţe molekulární biotechnologie
představují jedno z nejefektivnějších odvětví současného průmyslu a zatím jednu
z nejreálnějších představ o výzkumu jako výrobním nástroji.
2. MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST
Úvod do problematiky projektu
Základním cílem projektu je demonstrace a praktické provedení dílčích experimentů
vedoucích k biotechnologické produkci hyaluronové kyseliny (HA), pouţitelné pro
farmakologické účely. U člověka se HA tvoří jako součást chrupavky kloubů, synoviální
tekutiny kloubů, ale i kůţe, kde významnou měrou přispívá k hojení ran. Na HA, jako
součást mimobuněčné hmoty (extracelulární matrix), se prostřednictvím receptoru
(CD44) váţou buňky imunitní, aby zde mohly zahájit svou obrannou funkci. HA je dále
zapojena například do vývoje nervové soustavy. V neposlední řadě se HA uplatňuje při
nádorovém bujení a rozvoji metastáz.
Z chemického hlediska je ha lineární polymer tvořený opakující se sekvencí dvou
jednotek: D-glukuronové kyseliny a D-N-acetyglukosaminu spojených střídavými
glykosidickými vazbami β-1,4 a β-1,3 (Obr. 2.1).
10
Obrázek 2.1. Struktura kyseliny hyaluronové
Je známo, ţe některé bakterie z řádu Lactobacillales tvoří HA jako součást
bakteriálního pouzdra chránícího bakterii před působením imunitního systému hostitele.
Její struktura je identická s ha lidskou. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus
představuje jednu z bakterií pouţívaných k biotechnologické přípravě HA. Bakterie
produkuje mimo jiné enzym -glukuronidasu, odštěpující z neredukujícího konce HA
glukuronovou kyselinu (GK) viz. Obrázek. 2.2, která je dále metabolizována jako zdroj
energie. Geny podílející se na metabolismu GK jsou sdruţeny v jednom operonu (βglucuronic-acid-utilizing operon), jehoţ exprese je přítomností volné GK aktivována.
Aktivace operonu, ač finálně vedoucí k zisku energie z GK, představuje pro bakterii
významnou metabolickou zátěţ spojenou se zpomalením rychlosti dělení buněk.
Obrázek 2.2. -glukuronidasa štěpí glukuronosid na glukuronát
11
V této kapitole bude probrána základní terminologie a molekulárně biologické
techniky umoţňující pochopení veškerých dílčích metodických postupů vedoucích k
přípravě mutantního kmene Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který neexprimuje
enzym β-glukuronidasu v důsledku navozené ztrátové (deleční) mutace příslušného genu
(gusA).
Principiální výhodou biotechnologického pouţití bakteriálního kmene, který
netvoří β-glukuronidasu, je zvýšení rychlosti růstu mutantních bakterií a následné zvýšení
výtěţku ha z jednotkového objemu bakteriální kultury v důsledku energetické
úspory inaktivací β-glucuronic-acid-utilizing operonu.
Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO)
Jelikoţ v následujících kapitolách budou pouţívány některé pojmy, které usnadňují
popis metod molekulárního klonování, nejdříve uvedeme jejich definice, případně
vysvětlení souvislostí.
Operon – skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční
jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou
transkribovány do polycistronické mRNA.
Gen – základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti.
Strukturní gen – úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje
strukturu proteinu a RNA molekuly, ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich
exprese.
12
Operátor – oblast DNA, na kterou se váţe specifický protein (represor) bránící iniciaci
transkripce z přilehlého promotoru.
Promotor – oblast DNA, na kterou se váţe RNA polymerasa a transkripční faktory,
zahajující transkripci mRNA.
Cis-trans komplementační test – párovací test, slouţící k určení toho, zda dvě různé
recesivní mutace na opačných chromozomech diploidního organismu (pozice in trans) se
vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne,
postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako „test alelismu“ (Obr. 2.3).
Cistron – nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci ve výše
zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliţe tytéţ mutace
jsou na jednom chromozomu (v poloze in cis). Cistron je tedy slučitelný s pojmem
kódující částí jednoho genu.
Cis regulace – odpovídající cis poloze v cis-trans testu.
Polycistronická mRNA – mRNA kódující více neţ jeden protein.
Vnitřní místo nasedání ribozomů – vzhledem k tomu, ţe z polycistronické mRNA se
přepisují různé proteiny, musí docházet k nasedání a sestavení ribozomu i mezi úseky
mRNA kódující jednotlivé proteiny.
Obrázek 2.3. Princip segregačního cis-trans testu
13
Čtecí rámec – transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA a přinášejí nově
syntetizovanému peptidu další aminokyseliny k jeho prodluţování. Jednotlivé tRNA
rozlišují podle principu komplementarity příslušnou trojici nukleotidů na mRNA.
Z takovýchto trojic je souvisle vytvořena kódující část mRNA. Při návrhu klonovacích
postupů spojujících dvě oblasti genů kódujících budoucí fúzní protein je třeba bedlivě
dbát, aby při spojování dvou DNA vznikl opět souvislý sled tripletů bez vmezeření či
výpadku báze DNA, neboť jinak by došlo k posunutí čtení tripletů a k přepisu
nesmyslného proteinu.
Komplementarita bází – báze se spojují vţdy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné
dodrţet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování.
Kohezivní konce dvouvláknové DNA – jednovláknový úsek DNA molekuly přesahující
buď na 5’ nebo 3’ konci dvouvláknovou DNA, který v rámci komplementarity bází můţe
vázat komplementární úsek jiné DNA molekuly. Pokud na obou koncích DNA molekuly
„A1“ jsou přesahující konce odlišné sekvence (vzájemně nekomplementární) a DNA
„B2“ je ukončena konci komplementárními k úsekům molekuly „A1“, můţeme tyto dvě
molekuly spojit (ligovat) tak, ţe je předem zajištěna správná orientace obou úseků DNA
vůči sobě (Obr. 2.4). Kohezivní konce můţeme připravit štěpením DNA dvojšroubovice
DNA endonukleázou. Pokud pouţijeme dvě odlišně štěpící endonukleasy, vznikne DNA
úsek se dvěma různými kohezivními konci. Stejným ošetřením jiné molekuly vytvoříme
14
pár dvou DNA fragmentů, které je moţno následně stranově specificky spojit (Obr. 2.4).
Pouţitím restrikčních endonukleáz, které po rozštěpení DNA vytvoří přesahující konec
ve formě palindromu, je zajištěna komplementarita všech konců vzniklých štěpením
jednou endonukleázou.
Palindrom – sekvence DNA, která je vzájemně „komplementární“ podle svého středu
(AGCCT nebo ACTGCAGT).
Obrázek 2.4. Využití kohezivních konců pro jednosměrné klonování
Pro snadnější pochopení některých výše uvedených pojmů popišme stručně Lac
operon E. coli. Představuje jeden z prvních popsaných operonů. Je tvořen skupinou
přilehlých společně regulovaných genů zapojených do metabolismu laktózy lacZ, lacY a
lacA. Pokud buňky rostou v médiu bohatém na glukózu, exprese genů lac operonu je
blokována lac represorem (produkt přilehlého lacI genu), který se váţe na operátor a
brání tak nasedání RNA polymerasy. Pokud však buňky rostou v médiu obsahujícím
laktózu nebo její nemetabolizovatelné analogy jako isopropyl-1-thio-β-D-galaktosid
(IPTG), represor je vazbou β-galaktosidů uvolněn z vazby na operátoru a RNA
polymerasa můţe nasedat a zahájit transkripci polycistronické mRNA lac operonu. Gen
15
lacZ kóduje β-galaktosidasu, gen lacY kóduje permeasu pro β-galaktosidy a gen lacA
kóduje galaktosid-acetyltransferasu, enzymy nezbytné pro metabolické vyuţití laktózy.
Plasmid – extrachromozomální DNA, která se replikuje a můţe se přenášet z generace na
generaci, pokud je to pro hostitelskou bakterii výhodné. Příkladem výhodnosti je, ţe
plasmid kóduje protein zajišťující rezistenci na určité antibiotikum. Jiný příklad je, ţe
plasmid kóduje proteiny nezbytné pro vazbu bakterií na hostitelské tkáně v průběhu
infekce nebo umoţňuje bakterii lépe se bránit imunitnímu dozoru hostitele (například
povrchové antigeny borelií). Plasmid můţe být cirkulární (většina) nebo lineární (znám u
laktobacillů, borelií, streptomycet). Aby mohl být plasmid replikován, musí obsahovat
místo, kde je replikace zahájena. Nejčastěji pouţívané plasmidy jsou deriváty dvou
E. coli plasmidů ColE1 a pMB1. Oba plasmidy se vyskytují v hostitelské buňce v počtu
15–25 kopií. Toto číslo je kontrolováno plasmidovým replikátorem, coţ je úsek plasmidu
nesoucí začátek replikace ori a další regulační sekvence či geny kódující regulační
proteiny, nikoliv však polymerasy a endonukleasy. Replikátory ColE1 a pMB1 jsou
podobné. Replikátor ColE1 je dlouhý 600 párů bází, kóduje ori místo zahájení replikace
hostitelskou DNA polymerázou, RNA primer a dva negativní regulátory RNAI a protein
Rop. Všechny enzymy účastnící se procesu replikace pochází z hostitelské bakterie.
Kritickým bodem zahájení replikace je vytvoření správné sekundární struktury dočasně
vytvořeného RNAII transkriptu, syntetizovaného hostitelskou RNA polymerázou, která
spouští jeho rozštěpení hostitelskou RNázouH, a následné zahájení replikace hostitelskou
DNA polymerázou. Regulace replikace spočívá v narušení sekundární struktury RNAII
transkriptu vazbou regulační RNAI a stabilizací této vazby proteinem Rop, coţ znemoţní
zahájení replikace (Obr. 2.5). Mutací sekvencí RNAI či rop genů je moţné značně zvýšit
počet kopií plasmidu na jednu buňku. Některé mutace replikátoru vedou k počtu kopií na
jednu buňku aţ 3000. Na druhou stranu plasmidy s velmi nízkým počtem kopií se
replikují synchronně s buněčným cyklem hostitelské bakterie, neboť pro zahájení své
replikace vyţadují některé hostitelské proteiny, jejich exprese je spojena se zahájením
buněčného dělení. Tyto plasmidy většinou nesou geny zajišťující regulovanou segregaci
plasmidů mezi dceřiné buňky. Přehled replikátorů pouţívaných v molekulárním klonování
je uveden v Tab. 2.1.
Tabulka 2.1. Nejčastěji používané replikátory
Název
Příklad
Délka (bp)
Selekční znak
prototypu
Počet kopií a
Reference
Pmb1
Pbr322
4, 362
Apr, Tetr
Vysoký; 100 ÷ 300
Bolivar et al., 1977
16
Kanr, Tetr,
Cole1
Pmk16
~ 4,500
P15a
Pacyc184
~ 4,000
Vysoký; > 15
Kahn et al., 1979
Emlr, Tetr
Vysoký; ~ 15
Chang et al., 1978
r
Nízký; ~ 6
Stoker et al., 1982
Cole1imm
r
Psc101
Plg338
~ 7,300
Kan , Tet
F
Pdf41
~ 12,800
Trpe
Nízký; 1 ÷ 2
Kahn et al., 1979
R6k
Prk353
~ 11,100
Trpe
Nízký; < 15
Kahn et al., 1979
R1
r1drd-17
Pbeu50
~ 10,000
Apr, Tetr
Rk2
Prk2501
~ 11,100
Kanr, Tetr
Nízký – pod 30°C
Vysoký – nad 35°Cb
Nízký; 2 ÷ 4
Uhlin et al., 1983
Kahn et al., 1979
a
počet kopií odpovídá prototypovému plasmidu. Mutace v replikátoru můţe značně
ovlivnit počet kopií. Například u pUC řady (pMB1) mutace replikátorů vedou aţ k 1000
÷ 3000 kopiím na jednu buňku. Převzato z Current Protocols in molecular biology,
Wiley, New York.
b
citlivé na teplotu kultivace.
Inkompatibilita plasmidů – je stav, kdy dva neidentické plasmidy nemohou společně
koexistovat v jedné buňce dlouhou dobu, pokud nejsou oba udrţovány pomocí rozdílných
selekčních znaků, například antibiotik. K inkompatibilitě dochází zejména, pokud dva
plasmidy sdílejí podobné regulační mechanismy replikace. Inkompatibilita je důsledkem
neschopnosti korigovat fluktuace vyplývající z náhodné selekce jednotlivých kopií
k iniciaci replikace a následnému rozdělení plasmidů do dceřiných buněk. Jelikoţ ColE1
a pMB1 mají podobné replikátory, a jsou tedy podobně regulovány RNAI, jsou ve stejné
skupině inkompatibility a nemohou dlouhodobě koexistovat v jedné buňce. Pozor, dva
plasmidy vzniklé rekombinací (například vnesením dvou velmi podobných inzertů) se liší
pouze svou velikostí a jsou rovněţ inkompatibilní .
Episom – DNA element, který se můţe replikovat nezávisle na replikaci chromozomu
(stejně jako plasmid) nebo se můţe integrovat do chromozomu a zde se replikovat
společně s chromozomální DNA. Po opětném vystřiţení z chromozomu existuje jako
cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu.
Obrázek 2.5. Regulace replikace ColE1 a pMB1 plasmidu pomocí RNAII a Rop
17
MCS – místo v klonovacím plasmidu určené pro vnášení cizorodé DNA. Je tvořeno
úsekem DNA sloţeným z krátkých sekvencí rozlišovaných různými restrikčními
endonukleasami. Pro smysluplnost postupu tato restrikční místa nesmí být umístěna
v jiných oblastech plasmidu. V mnoha plasmidech je MCS umístěno uvnitř genu lacZ
jako součást lac operonu.
GMO – geneticky modifikovaný organismus. V průběhu molekulárního klonování
vnášíme různé DNA úseky do plasmidů a tyto vnášíme do hostitelských bakterií za
účelem selekce a amplifikace plasmidů. Vnesením cizorodé DNA jinou neţ přirozenou
cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugace přirozených plasmidů atd.).
Vzniká buňka, která obsahuje laboratorně manipulovanou DNA a podle definice se jedná
o geneticky modifikovaný organismus. Pro manipulace vedoucí ke vzniku GMO je nutné,
aby měla laboratoř povolení k této manipulaci od Ministerstva ţivotního prostředí – MŢP
(v kategorii rizika i stačí podat oznámení MŢP) – a aby pravidelně, jednou za rok,
oznámila MŢP formou ročního hlášení (vţdy k 15. únoru následujícího roku), jak
nakládala s GMO. Legislativa související s manipulací s GMO, jednotlivé kategorie a
způsoby nakládání jsou definovány zákony a vyhláškami České republiky (zákon
18
178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a
nařízeními Evropského parlamentu a rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). V ročním
hlášení je kladen důraz na dodrţení podmínek deklarovaných v oznámení o nakládání.
Toto roční hlášení musí schválit odborný poradce pro GMO, který je u kaţdé instituce
jmenován statutárním zástupcem. Pracovníci nakládající s GMO musí být pravidelně
školeni. Příklad obsahu pravidelné roční zprávy je uveden v Tab. 2.2.
Tabulka 2.2. Formulář ročního hlášení pro uzavřené nakládání s GMO
Uţivatel
Datum a číslo rozhodnutí o zápisu do seznamu uţivatelů
Pouţívané GMO (podle zápisu GMO v seznamu uţivatelů)
Odborný poradce
Účel nakládání s GMO
Pracoviště
Kontaktní osoba na pracovišti
Kategorie rizika
Přibliţné mnoţství pouţitých GMO
Veškeré změny v nakládání proti údajům uvedeným v ţádosti o zápis do seznamu uţivatelů
(např. Pokud nebyly některé GMO v uplynulém roce pouţívány)
Likvidace GMO
Mimořádné události v průběhu nakládání s GMO a přijatá opatření
Kontroly výskytu GMO mimo uzavřený prostor
Jakákoliv pozorovaná souvislost s přímým či nepřímým ohroţením lidského zdraví
Další poznatky získané při nakládání s GMO, které mají vliv na hodnocení rizika
Bude uzavřené nakládání s GMO pokračovat v dalším roce? Pokud ne, uvést důvod ukončení.
Pokud ano, jsou plánovány nějaké změny?
Shrnutí (porovnání skutečného průběhu nakládání s GMO s údaji uvedenými v ţádosti o
zapsání do seznamu uţivatelů)
E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA
V průběhu molekulárního klonování se téměř kaţdý experimentátor setká s nutností
vyuţít nějaký klonovací či expresní plasmid. Jejich konstrukce a amplifikace se,
19
s výhodou danou jejich původem, provádí s pomocí hostitelského mikroorganismu,
jakým je nejčastěji E. coli. Tato jedna z nejlépe prostudovaných bakterií umoţňuje velmi
přesně amplifikovat plasmidovou DNA, selektovat připravené rekombinantní varianty
plasmidu a v mnoha případech získat s vysokým výtěţkem i rekombinantní proteiny
plasmidem kódované.
E. coli je Gram negativní tyčka s cirkulárním chromozomem o velikosti zhruba 3.106
párů bází. Je schopna růstu na minimálním médiu obsahujícím zdroj uhlíku jako je
glukóza a soli, které jsou zdrojem dusíku, fosforu a stopových kovů. Na médiích
obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. však roste mnohem
rychleji. Po naočkování malého mnoţství bakterií (inokula) do obohacených médií se
bakterie po úvodní fázi lag dělí exponenciálně se zdvojovacím časem 20–30 minut. Tato
exponenciální fáze se nazývá log fáze. V log fázi růstu setrvává bakterie, dokud
nespotřebuje veškeré ţiviny či kyslík, nebo pokud mnoţství zplodin metabolismu, jako
jsou například kyseliny, nepřesáhne hranici inhibice růstu. Většina kmenů E. coli
pouţívaných při rekombinaci DNA je derivována z nepatogenní linie E. coli K-12,
izolované v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v
Kalifornii.
F faktor – fertility (nebo sex) faktor umoţňuje přenos genetického materiálu z jedné
E. coli, která F faktor obsahuje (F+, samčí, dárcovská) do druhé, která F faktor
neobsahuje (f-, samičí, příjemcovská) při procesu zvaném konjugace. F faktor můţe být
v buňce ve formě plasmidu, episomu, nebo jako součást bakteriálního chromozomu (Hfr
– high frequency of recombination). F plasmid tak, jak byl původně popsán, má délku
téměř 105 párů bází. Pro molekulárně biologické aplikace se pouţívá minimalizovaná
verze, která kromě genů záměrně vnesených do f plasmidu (nebo f episomu) obsahuje ori
místo pro zahájení replikace, rep gen kódující replikasu, případně par segregační geny
kódující jednotlivé podjednotky topoizomerasy IV a ccd (ccd stands for coupled cell
division) geny. S výhodou jsou do F plasmidu vnášeny geny rezistence na antibiotikum,
pomocí kterého je plasmid udrţován v následujících generacích a dále například gen
kódující ω fragment -galaktosidasy umoţňující α komplementaci.
Příkladem je F episom v bakterii XL-1 Blue F’[::tn10 proAB+ lacIq δ(lacZ)M15]. F’
označuje, ţe se jedná o bakterii, která je potomkem kmene, v němţ se F faktor
integrovaný do chromozomu uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále setrvává
ve formě episomu. Geny získané z chromozomální DNA jsou uvnitř hranatých závorek.
Zde se jedná o část transpozonu Tn10 nesoucího gen rezistence na tetracyklin, geny
proAB kódující γ-glutamyl fosfát reduktasu a kinasu, účastnící se metabolismu prolinu,
dále represor laktózového operonu lacI, který je z tohoto episomu nadprodukován, a gen
kódující ω fragment -galaktosidasy δ(lacZ)M15.
20
α komplementace – je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichţ jeden kóduje N’
terminální úsek -galaktosidasy (α fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek galaktosidasy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou
polypeptidových podjednotek po jejich translaci. To umoţňuje prokázat přítomnost obou
genů při kultivaci buněk v přítomnosti substrátu -galaktosidasy [X-Gal, (5-bromo-4chloro-3-indolyl-d-galaktosid)], vedoucí k modrému zabarvení buněk. Příkladem
vyuţití tohoto fenoménu je rychlé monitorování úspěšnosti vnášení DNA fragmentů do
klonovacích plasmidů. -galaktosidasa zde slouţí jako reporterový gen. Plasmidy vhodné
pro tyto aplikace mají MCS umístěné uvnitř genu lacZ, kódujícího  fragment galaktosidasy, jako součást modifikovaného lac operonu. Hostitelské E. coli exprimují ω
fragment -galaktosidasy nejčastěji z F’ episomu. Při vnesení DNA inzertu do MCS
dojde při translaci lacZ genu k porušení aminokyselinové sekvence  fragmentu galaktosidasy, která nemůţe  komplementací vytvořit funkční protein -galaktosidasu,
coţ je viditelné po naočkování bakterií na pevnou agarovou půdu s X-Gal a IPTG.
Kolonie bakterií nesoucích nerekombinovaný plasmid (bez DNA sekvence vnesené
dovnitř genu pro  fragment) jsou modré, kdeţto kolonie s vneseným DNA inzertem
modré nejsou (Obr. 2.6).
Obrázek 2.6. Modrá-bílá selekce transformovaných bakterií
21
Antibiotika – antibiotika představují neodmyslitelný nástroj v molekulárním klonování.
Umoţňují selektovat bakteriální linie, do nichţ byl úspěšně vpraven plasmid kódující
protein inaktivující pouţité antibiotikum. Gen pro tento protein (antibiotickou rezistenci)
se nachází mimo klonovací místo (oblast vnášení cizorodé DNA). Pomocí dalšího
antibiotika, nebo antibiotik, je dále moţné udrţovat v bakterii pomocné plasmidy či
episomy, pokud nesou příslušné geny rezistence. Takové plasmidy a episomy zajišťují
potřebné fenotypové vlastnosti konkrétního bakteriálního kmene.
Antibiotika jsou pouţitelná i pro selekci transfekovaných savčích buněčných linií.
Selekční tlak antibiotik umoţňuje mimo jiné selektovat buněčný klon, u nějţ se plasmid
integroval do genomické DNA, se kterou se přenáší na následující dceřiné generace.
Vzniká tak stabilně transfekovaná buněčná linie. Pokud byl integrován plasmid nesoucí
nejen gen rezistence na antibiotikum, ale i gen kódující rekombinantní protein, můţeme
selekcí získat klon s dostatečně vysokou produkcí daného rekombinantního proteinu.
Nejčastěji pouţívaná antibiotika při selekci bakterií jsou uvedena v Tab. 2.3.
Tabulka 2.3. Antibiotika používaná v molekulárním klonování
Název
Pracovní
Mechanismus působení
Mechanismus rezistence
Kanamycin
Gentamici
n
Chloramfenikol v
metanolu
Ampicilin
(mg/ml)
50–100
Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, -laktamasa hydrolyzuje ampicilin dříve,
inhibuje syntézu stěny potlačením neţ se dostane do buňky
tvorby příčných vazeb mezi
peptidoglykany
20
Bakteriostatický;
inhibuje Chloramfenikol
acetyltransferasa
proteosyntézu interakcí s 50s inaktivuje chloramfenikol
podjednotkou ribozomu a inhibuje
reakci peptidyltransferasy
15
Baktericidní;
inhibuje
proteosyntézu interakcí s l6
proteinem
50s
podjednotky
ribozomu
30
Baktericidní;
inhibuje Aminoglykozid
(neomycin)
proteosyntézu, inhibuje translokaci fosfotransferasa,
aminoglykozid
a vyvolává poruchy čtení tripletů
acetyltransferasa
a
aminoglykozid
nukleotidyl
transferasa
inaktivuje
gentamicin a kanamycin
22
Aminoglykozid
acetyltransferasa
a
aminoglykozid nukleotidyl transferasa
inaktivuje gentamicin; mutace v rplF
brání vazbě gentamicinu
v
Tetracyklin
70% etanolu
12
Bakteriostatický;
inhibuje Aktivní eflux tetracyklinu z buňky
proteosyntézu bránění ve vazbě
aminoacyl tRNA na místo a
ribozomu
Nonsense suppression – potlačení efektu stop kodonů v důsledku přítomnosti
abnormálních tRNA, které se váţou na stop triplet, přinášejí aminokyselinu a umoţňují
další průběh translace. Na moţnou přítomnost abnormálních tRNA je nutno myslet při
výběru E. coli pro zamýšlený experiment. Supresorové geny jsou uvedeny v genotypu
bakterie. Příklady supresorových genů jsou supD, supE atd. Většina supresorových tRNA
nasedá na stop kodony Amber (UAG) nebo Orche (UAA).
Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů
Při práci s mikroorganismy i tkáňovými kulturami je třeba dodrţovat zásady sterilní
práce, zejména při přípravě bakteriálního inokula. Ač je často komplikované kultivovat
zvolenou populaci buněk, kontaminace se můţe objevit, aniţ bychom jí to jakkoliv
usnadňovali. Nicméně zásady sterilní práce umoţňují minimalizovat toto riziko.
Pro přípravu sterilních kultivačních médií pro kultivaci bakterií, pufrů a vody se
nejčastěji pouţívá sterilizace autoklávováním. Při autoklávování se mikroorganismy ničí
nasycenou vodní parou při teplotě nejčastěji 121°C, po dobu minimálně 25–60 minut
a zvýšeném tlaku. Autoklávování je moţné opakovat za 24–48 hodin, coţ je čas nezbytný
pro vyklíčení eventuálně přítomných spór, které jsou jinak k autoklávování rezistentní.
Sklo, plast a nástroje se autoklávují za teploty 134°C po dobu 20–45 minut. Autoklávovat
lze i citlivější materiály, jako jsou plasty (polyetylen, polykarbonát, silikon; nevhodný k
autoklávování je polystyren, částečně se můţe poškodit polypropylen). Doporučení je
vţdy otestovat vhodnost konkrétního plastu pro autoklávování. Autoklávování se
nepouţívá pro sterilizaci médií pro tkáňové kultury.
Nástroje a sklo je moţné dále sterilizovat horkovzdušnou sterilizací za teploty 180°C
po dobu 1–2 hodiny. Horkovzdušná sterilizace se kromě vlastní sterilizace pouţívá
i k inaktivaci RNA pro účely přípravy materiálu na izolaci RNA. Zde je však nutné
pouţít mnohem drastičtější podmínky, a to 180°C po dobu 8 hodin. Horkovzdušná
sterilizace je vhodná zejména pro sterilizaci skla a nástrojů z nerez oceli. Není vhodná
pro sterilizaci ostrých nástrojů, neboť ostří se při opakovaném vystavení vysoké teplotě
vzduchu rychle tupí.
23
Komerčně dodávaný plast a pomůcky pro sterilní manipulaci se průmyslově sterilizují
zářením. Sterilizace etylenoxidem nebo formaldehydem není vhodná zejména pro
materiály přicházející do kontaktu s tkáňovými kulturami, neboť i nepatrné zbytky těchto
látek mohou působit toxicky na kultivované buňky.
Izolace rekombinantního proteinu je procedura, která sestává z několika klíčových
kroků. V první řadě je nutné zváţit, jaký expresní systém bude vhodný pro produkci
rekombinantního proteinu. Tomu je nutné přizpůsobit následující klonovací postup. Volba
expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinovaného proteinu, potřebou zachovat
nezbytné posttranslační modifikace, rozpustnost proteinu a poţadované mnoţství (Tab. 2.4,
2.5).
Následuje izolace cDNA kódující daný protein. V dalším kroku je třeba navrhnout,
sestavit, izolovat a namnoţit plasmid, který umoţní expresi rekombinantního proteinu.
Na závěr je tento plasmid vnesen do vhodného hostitele, který podle něj vytváří
rekombinantní protein. E. coli zde slouţí jako vysoce přesný nástroj umoţňující selekci a
amplifikaci rekombinovaných plasmidů vzniklých molekulárním klonováním a
vnesených do E. coli některou z takzvaných transformačních metod. Transformované
bakterie jsou naočkovány na tuhé agarové kultivační půdy tak, aby kolonie, které zde
vyrostou, byly od sebe dostatečně prostorově separovány. Díky fenoménu
inkompatibility plasmidů nesou kolonie, které vyrostou z bakterií naočkovaných na tuhou
půdu, jen jednu variantu rekombinovaného plasmidu. Aby na tuhé půdě narostly pouze
E. coli, které nesou rekombinovaný plasmid, obsahuje kultivační půda antibiotikum, ke
kterému jsou odolné pouze bakterie obsahující plasmid (plasmidem transformované
bakterie, rekombinované bakterie), neboť plasmid kóduje znak rezistence na příslušné
antibiotikum. Selekce jednotlivých kolonií nesoucích plasmid je nezbytná proto, ţe
rekombinované plasmidy vzniklé molekulárním klonováním nejsou vţdy správně
sestavené, mohou obsahovat kontaminující DNA, mohou nést různé mutace, nemusí
obsahovat ţádnou vnesenou cDNA, či mohou obsahovat vnesenou cDNA v nesprávné
orientaci atd..
Jiná situace nastává při produkci polysacharidu jako ha. Zde vycházíme ze spontánní
tvorby dané makromolekuly (HA), molekulární klonování a manipulace s expresní
bakteriální linií slouţí pouze ke zvýšení výtěţku makromolekuly produkované vybraným
kmenem bakterií přirozeně se vyskytujícím v přírodě.
Tabulka 3.4. Velikost rekombinantního proteinu a expresní systémy
Velikost proteinu
E. coli
Kvasinky
Povaha proteinu
24
Hmyzí buňky
Savčí buňky
< 8 kDa
+++
Fúzní
> 8 kDa
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
Intracelulární
8–50 kDa
Sekretované
> 50 kDa
+++
Sekretované a povrchové
Bakteriální expresní systémy
Bakteriální systémy jsou pouţívány pro klonování DNA i pro expresi
rekombinantních proteinů. Výhodou bakteriálního systému, zejména E. coli, je dobrá
znalost jejich chování a kultivačních podmínek, krátký zdvojovací čas E. coli, dostupnost
efektivních metod pro transformaci, izolaci DNA i rekombinantních proteinů atd. Vhodné
linie E. coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy, ale i obří plasmidy bacmidy, které
mají velikost několika stovek párů bází.
E. coli rostou jak v tekutých, tak na tuhých plotnách v normální atmosféře při
teplotách od 23°C do 37°C. Při klonování DNA se pouţívá standardně 37°C. Pro expresi
rekombinantních proteinů je moţno pouţít teplotu 37°C, nebo teplotu sníţit, čímţ se
můţe sníţit i potenciální toxicita rekombinantního proteinu.
Při produkci rekombinantního proteinu v E. coli dosahujeme obecně nejvyšších
výtěţků dosahujících aţ 5 gramů proteinu na 1 litr biomasy (Tab. 2.5). Rekombinantní
proteiny produkované v E. coli však nejsou dostatečně posttranslačně modifikovány
(chybí obecně: N-glykozylace, C-glykozylace, tvorba disulfidických můstků, štěpení
prekurzorových proteinů specifickými proteasami, skládání proteinu). Jelikoţ jejich
intracelulární transport je většinou odlišný od situace při jejich přirozené produkci a
asistenční proteiny, jako proteiny tepelného šoku (hsp), mohou mít poněkud odlišné
funkce v bakteriálním hostiteli, mohou se rekombinantní proteiny exprimované v E. coli
shlukovat do inkluzních tělísek lokalizovaných v cytoplasmatickém nebo
periplasmatickém prostoru.
Tabulka 2.5. Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi
25
Kvasinky
Protein
E. coli
Hmyzí buňky
Savčí buňky
0,001 ÷ 0,5
0,001 ÷ 0,1
P. pastoris, S.cerevisiae
Sekretovaný
< 0,5
0,2 ÷ 4
≤ 0,25
0,5 ÷ 5
0,2 ÷ 12
1÷4
[g/l biomasy]
Intracelulární rozpustný
0,001
[g/l biomasy]
Intracelulární inkluze
0,5 ÷ 5
1÷4
[g/l biomasy]
E. coli vytváří inkluzní tělíska přirozeně za účelem ukládání zásob. U savčích buněk
vznikají inkluzní tělíska nejčastěji z virových kapsidových proteinů. Nejsou ohraničena
membránou. Inkluzní tělíska z rekombinantních proteinů jsou tvořena nerozpustnými
agregáty nesprávně sloţeného proteinu bez biologické aktivity. Velikost inkluzních
tělísek se pohybuje od 0,2 do 0,6 m. Jsou pozorovatelná ve fázovém kontrastu jako
temná intracelulární tělíska. Sekrece rekombinantního proteinu je jednou z cest
minimalizace tvorby inkluzí. Sekrece proteinů přes dvojitou buněčnou membránu E. coli
je však velmi málo efektivní a pro velké rekombinantní proteiny většinou dosud
technologicky nezvládnutá. Nicméně jsou popsány mechanismy, které zřejmě
v budoucnu umoţní modifikaci rekombinantních proteinů k efektivní sekreci. Sekrece se
děje prostřednictvím transportních drah, kterých bylo u E. coli popsáno šest.
Sekrece typu I je závislá na ABC transporterech (ATP-binding cassette) a proteiny
prochází periplasmatickým prostorem pomocí kanálu, který je od něj do jisté míry
izoluje. Vyuţití sekrečního mechanismu typu i je limitováno velikostí efektivně
sekretovaných proteinů. Její hodnota je pod 200 aminokyselin. Sekrece je navozena
připojením sekretorního signálu (HlyA) k C’ konci rekombinantního proteinu, který je
moţné po izolaci proteinu odstranit enzymaticky.
Sekrece typu II je závislá na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle) nebo TAT
(twin-arginin translocation) drahách. Tyto dráhy jsou zodpovědné za první krok
sekrečního mechanismu typu II – transport do periplasmatického prostoru. 1) SEC
sekrece je zodpovědná za sekreci většiny rekombinantních proteinů do periplasmatického
prostoru. U proteinu je před transportem přes sec nejdříve rozvolněna vyšší konformační
struktura a po vstupu do periplasmatického prostoru je protein opět sloţen do vyšší
konformace. Na této dráze je zapojeno minimálně 9 proteinů (Trigger Factor, SecA,
SecB, SecY, SecE, SecG, SecD, SecF a YajC). 2) SRP závislá sekrece probíhá jako
26
jediná kotranslačním mechanismem, coţ znamená, ţe protein je translokován do
periplasmatického prostoru dříve, neţ se poprvé sloţí. Tato dráha je biotechnologicky
vyuţitelná pro rychle se skládající proteiny, jako jsou DARP proteiny (designed ankyrin
repeat proteins). 3) dráha TAT je jediná, která translokuje plně sloţené proteiny přes
vnitřní membránu buňky. Signální sekvence vyuţitelné pro transport rekombinantních
proteinů jsou známy. Ne kaţdý rekombinantní protein však můţe být transportován
uvedenými drahami a je nutné laboratorně ověřit jejich vhodnost. Následující sekrece
proteinu mimo buňku je realizována zřejmě společným transportním mechanismem, který
je zprostředkován komplexem 12–16 proteinů, které jsou doposud málo popsány a které
nejsou efektivně exprimovány za laboratorních podmínek. Sekrece typu II je
mechanismus zodpovědný za kumulaci mnoha rekombinantních proteinů
v periplasmatickém prostoru, kde mohou vytvářet inkluzní tělíska. Výhoda sekrece
rekombinantního proteinu v E. coli spočívá v tom, ţe proteiny prochází periplasmatickým
prostorem, kde jsou vystaveny lokálním disulfid-izomerasam a foldasam, které přispívají
ke správnému sloţení proteinu. V periplasmatickém prostoru je navíc méně proteas neţ
v cytoplasmě (Obr. 2.7).
Obrázek 2.7. Sekretorní dráha typu II v E. coli
27
Tvorba inkluzních tělísek můţe být potlačena sníţením teploty kultivace E. coli,
pouţitím slabšího promotoru nebo sníţením koncentrace induktoru exprese (například
IPTG u proteinů exprimovaných z laktózového operonu). Vznik inkluzních tělísek
komplikuje izolaci proteinu a často vyţaduje pouţití denaturačních činidel k jejich
rozpuštění. Na druhou stranu je moţné inkluzní tělíska nejdříve separovat centrifugací,
potom rozpustit a protein následně renaturovat takzvaným refoldováním proteinu do jeho
správné vyšší konformace, coţ můţe vést k dosaţení vyšší finální čistoty
rekombinantního proteinu.
Problémem produkce proteinů v E. coli se můţe stát kontaminace lipopolysacharidem
– lipofilní sloţkou buněčné stěny Gram negativních bakterií, která v savčím organismu
vyvolává reakci imunitního systému spojenou se zvýšenou teplotou a vyplavením
prozánětlivých cytokinů (Obr. 2.8). Působí tedy jako tzv. pyrogen. Pokud je
lipopolysacharidu, taky zvaného endotoxin, aplikováno větší mnoţství aplikováno do
krevního oběhu, můţe vyvolat aţ šokový stav ohroţující jedince na ţivotě. Přítomnost
endotoxinu můţe být tolerovatelná při aplikacích produktu in vitro, ale pro aplikace in
vivo je vţdy nutná depyrogenace. Ta se dá provádět metodami chromatografickými, ať uţ
jde o iontoměničovou chromatografii, gelovou permeační chromatografii či
chromatografii afinitní (např. Za vyuţití imobilizovaného polymyxinu, polylyzinu nebo
proteinu váţícího lipopolysacharid - LBP). Je také moţno vyuţít extrakci endotoxinu do
organické fáze tvořené detergentem, např. Tritonem-X114. Tyto metody však často
sniţují finální výtěţek produktu a mohou ovlivnit stabilitu a nativní konfiguraci proteinu.
Náročné je také testování obsahu endotoxinu . Pro velkou biologickou aktivitu jiţ malého
mnoţství je nutno provádět bilogický test zaloţení na lyzátu amebocytů hrotnatce druhu
Limulus polyphemus (LAL – limulus amebocyte lysate).
28
Obrázek 2.8. Struktura molekuly lipopolysacharidu
E. coli je moţné kultivovat v různých modifikacích minimálních nebo
obohacených kultivačních médií (bujónů).
Minimální médium: A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g
KH2PO4; 10,5 g K2HPO4; 0,5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4 x 7H2O; 0,2% glycerol
(nebo cukr).
Bohatá média: Luria-Bertani nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g
tryptonu; 5 g kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH). H medium: obsahuje v 1
litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl. Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g
tryptonu; 2,5 g NaCl.
E. coli přes uvedené limitace představují jeden z nejvíce pouţívaných expresních
systémů. V případě nutnosti zachovat nezbytné posttranslační modifikace se pouţívá
evolučně vyšší, ale finančně náročnější expresní systém – nejčastěji kvasinkový nebo
savčí. Srovnání zastoupení jednotlivých expresních systémů pro komerční produkci
rekombinantních proteinů je uvedeno v Tab. 2.6.
29
Tabulka 2.6. Posttranslační modifikace rekombinantních proteinů
Posttranslační modifikace
Expresní
systém
N-glykozylace
O-glykozylace
Fosforylace
E. coli
Chybí
-
-
-
-
-
+
+
+
+
-
Kvasinky
Vysoce
manosilované
glykany
Hmyzí buňky
Jednoduchá, bez
sializace
+
+
+
+
-
Savčí buňky
Komplexní
+
+
+
+
+
Acetylace Acylace γ-karboxylace
Kvasinkové expresní systémy
Kvasinky představují eukaryontní expresní systém, který obecně mnohem vhodněji
posttranslačně modifikuje rekombinantní proteiny eukaryontního původu. Rovněţ
sekrece proteinu je dobře realizovatelná připojením sekretorních signálů. Příprava
expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a
charakterizovat několik expresních kvasinkových klonů, neboť obvykle se intenzita
tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu. Nicméně produkce
rekombinantních proteinů v kvasinkách je oproti savčím expresním systémům levná.
Kvasinky je moţné kultivovat do vysokých koncentrací buněčné suspenze a zdvojovací
čas kvasinek je oproti savčím buňkám mnohem kratší. Nejčastěji se pouţívají
Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Obě kvasinky se zásadně liší zejména
v dosaţitelné sekreci rekombinantního proteinu a podílu sekretovaného proteinu z
celkového mnoţství proteinů syntetizovaných buňkou, které pro S. serevisiae dosahuje
maximálně 1 % kdeţto u P. pastoris aţ 10 % (Tab. 2.7).
Tabulka 2.7. Srovnání četnosti komerčního využití jednotlivých expresních systémů
Společnost
Produkt
Koagulační faktory (VII, VIII, IX)
Systém
Novo-Nordisk/Bayer/Centeon
BHK buňky
Genetics Baxter/Centeon/Wyeth
CHO buňky
Unigene
E. coli
Calcitonin
CHO buňky
30
DNasa (cystická fobróza)
Roche
CHO buňky
Erythropoetin
Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer
CHO buňky
Darbepoetin
Amgen
CHO buňky
Serono/Organon
CHO buňky
Luteinizační hormon
Serono
CHO buňky
Gonadotropin
Serono
CHO buňky
Novo-Nordisk
S. cerevisiae
Genzyme
CHO buňky
Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring
E. coli
Serono
Myší linie
Serono/Bio-Technology Gener. Corp
CHO buňky
Lg Chemical
S. cerevisiae
Novartis/Essex/Amgen/Roche
E. coli
Chugai Pharmaceuticals
CHO buňky
Platelet derived growth factor (PDGF)
Janssen-Cilag
S. cerevisiae
PDGF-agonista
Zymogenetics
S. cerevisiae
Glaxosmithkline
S. cerevisiae
Rhein-Biotech
H. polymorpha
Aventis/Novartis
S. cerevisiae
Aventis/Lilly/Berlin-Chemie
E. coli
Bio-Technology General Corp
E. coli
Novo-Nordisk
S. cerevisiae
Roche/Essex/Yamanouchi
E. coli
Schering
E. coli
Biogen/Serono
CHO buňky
Amgen/Boehringer
E. coli
Interleukin 2
Chiron
E. coli
Oprelvekin (agonista IL-11)
Wyeth
Romi 8866
Curis/Striker
E. coli
Tkáňový aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
CHO buňky
Aktivátor plasminogenu
Genentech/Roche/Boehringer
E. coli
Amgen
CHO buňky
Folikuly stimulující hormon
Glukagon
Glukocerebrosidasa (Gaucherova nemoc)
Růstové hormony (somatotropiny)
Eutropin
Growth factors (GCSF, GMCSF)
Hepatitis B vakcína
Hirudin
Insulin a muteiny
Insulin
Interferon alpha a muteins
Interferon beta
Interferon gamma (mutein)
Op-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt)
Faktor kmenových buněk (SCF)
31
Tumor nekrosis faktor (TNF)
Boehringer
E. coli
Modifikováno podle Schmidt, 2004
Kvasinky, na rozdíl od savčích buněk, tvoří jiné struktury N-glykanů (převáţně
vysoce manosilované, high mannose), které připomínají savčí prekurzory nacházející se
v endoplasmatickém retikulu. Tyto jsou savčími buňkami většinou dále modifikovány na
kratší řetězce, v nichţ terminální manosa je nahrazována N-acetylglukozaminem,
galaktózou, fukózou a sialovou kyselinou za vzniku hybridních a komplexních noligosacharidů. Kvasinkové buňky je moţné modifikovat vnesením vektorů kódujících
nezbytné manosidasy (MI a MIIx) a glykozidasy (Obr. 2.9, 2.10). U rekombinantního
glykoproteinu musí být tedy předem podrobně analyzována glykozylace. Exprese
glykozyltransferáz musí být pak upravena výměnou odpovídajících promotorů za silnější
či slabší, nebo musí být pouţita rekombinovaná hostitelská linie, která produkuje
potřebné glykozyltransferasy a podobně. To samozřejmě komplikuje proces přípravy
vhodného kvasinkového klonu pro expresi rekombinantního proteinu.
Obrázek 2.9. Struktura N- a O-oligosacharidů u savčích glykoproteinů
32
Fukozylace je proces připojování fukózy na různé pozice zejména Ooligosacharidů. Kvasinky normálně nepřipojují fukózu k oligosacharidům na tvořených
glykoproteinech. Proto expresi fukozylovaných proteinů je tedy nezbytné pouţít
33
geneticky modifikované kvasinky, nebo přejít na evolučně vyšší expresní systém.
Genetická modifikace kvasinek k produkci fukozylovaných proteinů byla publikována
poprvé v roce 2008 .
Obrázek 2.10. Syntéza  1,6 GlcNAc rozvětvených N-oligosacharidů
O-glykozylace představuje další rozdíl v posttranslační modifikaci mezi savčími a
kvasinkovými expresními systémy. U kvasinek a jiných houbových mikroorganismů je oglykozylace zahájena v endoplasmatickém retikulu přenosem manosových zbytků
z dolichyl fosfát D-manosy na specifický serin nebo treonin aminokyselinové páteře
proteinu . V této chvíli je jiţ protein sloţen a lokální poměry rozhodují o průběhu Oglykozylace. To, který z uvedených serinů a treoninů bude O-glykozylován, je velmi
těţké předpovědět a prakticky se to dá s jistotou říci jedině aţ na základě analýzy
glykozylace vytvořeného proteinu. Experimentální průkaz O-glykozylace IGF (insulinu
podobný růstový faktor) a IL-2 produkovaných v kvasinkách a v savčích buňkách ukázal
zásadní rozdíly mezi oběma systémy. Jiné proteiny jsou glykozylovány v obou systémech
identicky (hGM-CSF) . Odhadnout glykozylaci proteinu je moţné pomocí některých
predikčních programů pracujících na principu neuronálních sítí. Tyto programy pracují
většinou tak, ţe hledají strukturní podobnosti s jinými proteiny, u nichţ byla glykozylace
experimentálně popsána. Příkladem je server dánského technického institutu
(http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc), který předpovídá pravděpodobnost připojení
34
O-vázaných oligosacharidů v savčích buňkách. Prostřednictvím serveru je moţné
provádět
odhad
i
mnoha
dalších
posttranslačních
modifikací
(http://www.cbs.dtu.dk/services/). Pro kvasinkové expresní systémy však specifický
predikční nástroj zatím není vyvinut.
Hmyzí expresní systémy
Jedním ze systémů majících výhody jak eukaryontních, tak částečně i
prokaryontních expresních systémů jsou systémy hmyzí – bakulovirové, označované
podle hlavního nástroje vnášení DNA do hostitelských buněk – bakuloviru, velkého
hmyzího dvouvláknového DNA viru Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) nevirulentního pro savce. Tento expresní systém na rozdíl
od ostatních pracuje v standardním uspořádání tak, ţe exprese proteinu se neděje
z buněčných linií stabilně transfekovaných, jako je tomu u savčího systému a v podstatě i
u bakteriálního systému, ale DNA kódující rekombinantní protein je vnášena do kultury
hmyzích buněk formou infekce rekombinovaným bakulovirem. Příprava, ověření a
udrţování dostatečného mnoţství infekčních virových partikulí (viral stock) představuje
nejnáročnější krok celé bakulovirové technologie. Jako hostitelské buňky slouţí larvální
kultura buněk můry autographa californica nebo Spodoptera frugiperda (Sf9) (Obr.
2.11).
V současnosti jsou komerčně dostupné i vektory pro přípravu stabilně
transfekovaných linií hmyzích buněk umoţňující vynechat náročné udrţování a kontrolu
suspenze rekombinovaných virů.
Obrázek 2.11. Postup přípravy rekombinovaného bakuloviru
35
Výhody bakulovirového expresního systému spočívají zejména ve vysoké
výtěţnosti a nepřítomnosti endotoxinu, v podobnosti posttranslační modifikace proteinu
s modifikací probíhající v savčích buňkách, v efektivní efektivní sekreci proteinů
a v dostupnosti bezsérových médií usnadňující purifikaci sekretovaných rekombinantních
proteinů.
N-glykozylace rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách je převáţně typu
vysoce manosylovaných oligosacharidů (high mannose). O-glykozylace je podobná savčí
glykozylaci, nicméně místa připojení cukrů Ser, Thr jsou opět dána specifickým
rozlišením glykozylačních motivů, které nemusí být vţdy identické se savčími.
V současnosti je dostupná hmyzí linie „Mimic™ Sf9“, která stabilně exprimuje několik
savčích glykozyltransferas umoţňujících tvořit rekombinantní proteiny s dvojitě
větvenými N-vázanými oligosacharidy (nesou dva N-acetylglukosaminy na první
větvičce manosy), které jsou terminálně sialylované, čímţ se více podobají savčím
proteinům.
36
Savčí expresní systémy
Vlastnosti jednotlivých buněčných populací v následujících kapitolách budou
uvedeny zejména ve vztahu k biotechnologickým potřebám produkce rekombinantních
proteinů a glykoproteinů.
V závislosti na původu proteinu či glykoproteinu, který chceme připravit
rekombinantní technologií a v závislosti na vlastnostech, které od něj poţadujeme, je
nutné volit expresní systém. Pro savčí proteiny je nejvhodnější pouţít příslušný savčí
systém. Tím je zajištěna adekvátní posttranslační modifikace, jako je acylace,
fosforylace, lipidizace, glykozylace, citrulinace, tvorba disulfidických můstků a mnoho
dalších, které evolučně niţší systémy většinou realizují jen částečně.
Problém exprese rekombinantních proteinů v savčích liniích spočívá ve vysoké
finanční náročnosti a relativně nízkém výtěţku. Z našich zkušeností vyplývá, ţe
očekávaný výtěţek z kultury adherentních buněk kultivovaných na ploše 1 m2 je řádově
ve stovkách mikrogramů aţ jednotkách miligramů. Významným faktorem je zde buněčná
linie pouţitá k expresi glykoproteinu. Nejvyšší výtěţnost dosahují linie lidských
embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského
(CHO). I zde se však ukazuje, ţe buněčné linie pocházející z tkání téhoţ organismu
produkují proteiny lišící se v posttranslační modifikaci, coţ můţe představovat překáţku
následného pouţití glykoproteinu například pro imunizaci, jejímţ cílem je navození
protilátek proti cukerné komponentě antigenu.
Pro dosaţení vysokého výtěţku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii
buněk, coţ znamená, ţe vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí
integrovat do genomu buněk a potom se mnoţí společně s mnoţícími se buňkami.
Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo
dominantní selekce. Dominantní selekce znamená pouţití chemikálie normálně toxické
pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenţ se produkuje z genu
lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Nejdříve tedy v plasmidu,
který vneseme do buňky, a posléze v genomu, kam se plasmid integroval. Selekce
stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyţaduje průběţné monitorování míry
exprese proteinu, neboť se můţe stát, ţe jinak dojde k selektování klonu rezistentního na
selekční marker, ale neprodukujícího dostatečné mnoţství rekombinantního proteinu.
Příčinou je to, ţe v genomu hostitelské buňky je integrována jen část plasmidu kódujícího
rezistenci na selekční marker nebo ţe exprese rekombinantního proteinu, která zatěţuje
metabolicky buňku, je potlačena.
Produkci rekombinantního proteinu je moţné zvýšit procesem amplifikace genu
kódujícího rekombinantní protein po genomu buňky dlouhodobou kultivací (několik
týdnů) buněk za selekčních podmínek (Tab. 2.8).
37
Tabulka 2.8. Amplikační markery pro savčí buňky
Selekce
Gen
Adenosin, alanosin a 2’-deoxycoformycin
Adenosin deaminasa
Adenin, azaserin a coformycin
Adenyláte deaminasa
-aspartyl hydroxamát nebo albizzin
Asparagin syntetasa
Pala
Aspartát transcarbamoylasa
Metotrexát
Dihydrofolát reduktasa
Methionin sulfoximin
Glutamine syntetasa
Cadmium
Metalotionein
-difluorometylornithin
Ornithin dekarboxylasa
6-azauridine nebo pyrazofuran
Ump syntetasa
Mykofenolová kyselina
Xantin-guanin phosphoribosyltransferasa
Příkladem je selekce buněk metotrexátem, kdy dochází k amplifikaci genu
kódujícího dihydrofolát reduktasu (DHFR), který byl vnesen prostřednictvím
rekombinantního plasmidu do buňky s deleční mutací obou alel genu kódujícího DHFR
(například linie CHO DG44, Invitrogen). To by samo o sobě nemělo smysl pro produkci
zvoleného rekombinantního proteinu. Pokud však plasmid konstruujeme tak, ţe dhfr gen
je umístěn za gen kódující rekombinantní protein a oddělen je místem umoţňující
nasedání ribozomu, transkribovaná mRNA je bicistronická a oba proteiny jsou
translatovány z jedné mRNA molekuly. Toto uspořádání vylučuje, ţe by se do genomu
integroval pouze úsek mRNA kódující DHFR, neboť by gen ztratil promotor, a byl by
nefunkční. Vnitřní místo pro nasedání ribozomu (internal ribosome entry sites; IRES)
bývá v komerčně dostupných plasmidech pro laboratorní aplikace odvozeno například od
funkční jednotky popsané u polioviru a viru encefalomyokarditidy. Příkladem je plasmid
pOptiVEC (Invitrogen), který obsahuje klonovací místo pro vnášení DNA konstruktu, za
kterým následuje IRES odvozené z viru encefalomyokarditidy, z nějţ je zahájena
translace následujícího cDNA úseku kódující DHFR. Tento plasmid mimo jiné umoţňuje
rychlé vnášení cDNA amplifikované pomocí PCR s pouţitím polymerasy přidávající na
oba 3’ konce PCR amplikonu netemplátový dA (standardní Taq polymerasa). Efektivita
klonování je zvýšena tím, ţe plasmid se dodává jiţ otevřený a na oba konce
linearizovaného plasmidu je kovalentně připojena topoizomerasa i viru vakcinie. Ligační
reakce pak můţe probíhat pouhých 5 minut za pokojové teploty (Obr. 2.12).
38
Při produkci virových proteinů v savčím expresním systému se můţeme setkat
s nečekaně nízkou výtěţností. To můţe být způsobeno tím, ţe virem kódovaná mRNA
má jiné zastoupení tripletů (kodonů) neţ běţná zdravá savčí buňka. Důsledkem je, ţe
buňka nemá dostatek některých tRNA pro translaci proteinu. Řešení nabízí takzvaná
procedura optimalizace kodonů (codon optimisation), kterou je moţné dnes provést
pomocí různých webovských aplikací in silico. Princip spočívá v tom, ţe cDNA daného
proteinu se přepíše do sekvence aminokyselin a zpětně se přiřadí nová cDNA tak, aby
poměrné zastoupení tRNA v hostitelské buňce odpovídalo poměrnému zastoupení
příslušných tripletů. Nově navrţenou cDNA pak musíme připravit buď cílenou
mutagenzou, pokud mnoţství záměn nukleotidů není velké, nebo je moţné syntetizovat
úseky cDNA lišící se od původní cDNA a těmito nahradit původní nebo syntetizovat
celou cDNA. Výtěţek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho
řádu, ale i to je významné zlepšení. Kodonová optimalizace můţe významnou měrou
zefektivnit například i DNA vakcinaci, zejména pokud antigen kódovaný DNA vakcínou
pochází z evolučně vzdáleného organismu, jako jsou houby, bakterie anebo jiţ zmíněné
viry. Před přistoupením ke kodonové optimalizaci in vitro je nejdříve nutno zváţit její
potenciální přínos, nejlépe pilotním laboratorním experimentem.
Obrázek 2.12. Bicistronický plasmid při amplifikaci genu pomocí DHFR
39
Tkáňové kultury savčích buněk jsou z hlediska poţadavků na zkušenosti
experimentátora nejnáročnější. Jak jiţ bylo uvedeno na začátku kapitoly, je nezbytné
zachovat aseptičnost veškeré manipulace s buňkami. Jako pojistka se do tkáňových kultur
přidávají antibiotika, bránící růstu eventuální kontaminace. V některých situacích však
jejich přítomnost můţe sniţovat efektivitu některých nezbytných kroků, jako je vnášení
rekombinovaných expresních plasmidů (transfekce) do buněk. Nejčastěji pouţívaná
antibiotika a jejich pracovní koncentrace jsou uvedena v Tab. 2.9. Obvykle se pouţívá
trvale kombinace penicilinu a streptomycinu.
Tabulka 2.9. Antibiotika používaná standardně pro tkáňové kultury
40
Finální koncentrace
Antibiotikum
Penicilin
50–100 u/ml
Streptomycin sulfát
50–100 g/ml
Kanamycin
100 g/ml
Gentamicin
50 g/ml
Mykostatin
20 g/ml
0,25 g/ml
Amfotericin b
Pro kultivaci savčích buněk se většinou pouţívají komerčně dodávaná média,
která se doplňují L-glutaminem, bovinním fetálním sérem jako zdrojem nutrientů a
růstových faktorů a antibiotiky. Základní média jsou:
BME (basal medium Eagle’s): originální Eaglovo médium pro HeLa buňky v kultuře
obsahuje Earleyho balancovaný solný roztok.
MEM, E-MEM (minimum essential medium): Eaglem modifikované BME. Vyšší
koncentrace aminokyseli. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok nebo Hankův
solný roztok, obohacena o neesenciální aminokyseliny. Obsahuje 2 mm L-glutamin.
DMEM (Dulbeccos modified Eagle’s medium): Dulbekova modifikace bazálního
Eaglova média. Obsahuje 4x vyšší koncentraci aminokyselin a vitamínů. Dvě
modifikace: high (4,5 g/l glukózy) a low (1,0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4 mm Lglutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného.
RPMI 1640 (Rosswell park memorial institute): 1966 Moor, je modifikací McCoyova
basálního 5A média. Při pH > 8 růţová barva a zákal – obsahuje fenolovou červeň. Je to
způsobeno volnými bazickými amonokyselinami, které jsou méně rozpustné při
bazickém pH. Při neutrálním pH je čiré a má růţovou barvu, jako ostatní média.
Obsahuje 2 mm L-glutamin.
Výběr genu a jeho izolace
Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Prokaryontní geny jsou bez intronu. Pro klonování tedy není nutné pracovat
s mRNA tak, jak je tomu v případě eukaryontních genů. Moţnosti identifikace genu pro
izolaci cDNA umoţňující přípravu rekombinantního proteinu jsou principiálně podobné
jako u eukaryot. Pokud je známa sekvence poţadovaného genu, je moţné s výhodou
pouţít PCR amplifikaci s pomocí specifických primerů.
41
Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein
Eukaryontní geny jsou mnohem sloţitější. Genomická DNA obsahuje nejen
oblasti, které kódují strukturu proteinu, ale i introny a dlouhé 5’ a 3’ nepřekládané
oblasti. Proto při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cDNA připravenou reverzní
transkripcí mRNA izolované z buněk. Odpadá tím komplikovaná a ne vţdy přímá cesta
eliminace intronů, respektive identifikace rozhraní mezi jednotlivými exony a introny.
Příkladem webovské aplikace vyhledávání intron-exon rozhraní je například NetGene2
server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). Výhodné je pouţít genové databáze,
ve kterých jsou uloţeny sekvence značného mnoţství proteinů, cDNA nebo mRNA.
Porovnáním sekvence izolovaného genu je tak moţno odhadnout strukturu mRNA.
Jednodušší cesta přípravy cDNA reverzní transkripcí mRNA je usnadněna tím, ţe
eukaryontní mRNA má specifické struktury na obou koncích. Na 5’ konci mRNA se
nachází metylační čepička, kterou je moţné pouţít při izolaci mRNA v plné délce
například metodou GeneRacer (Invitrogen), kdy je metylační čepička na 5’ konci mRNA
odstraněna kyselou pyrofosfatasou (TAP) a k uvolněnému terminálnímu fosfátu je
připojen syntetický RNA oligonukleotid (budoucí místo nasedání PCR primeru) pomocí
T4 RNA ligasy. Aby nebyly tytéţ RNA oligonukleotidy připojeny i k fragmentům RNA,
které byly izolovány společně s mRNA, provádí se před odstraněním čepičky
defosforylace volných konců izolované RNA pomocí alkalické fosfatasy (CIP). Po
připojení RNA primeru na 5’ konec mRNA se provede standardní reverzní transkripce
pomocí reverzní transkriptasy a oligo dT primeru a získaná cDNA je pouţitelná k
amplifikaci 5’ a 3’ úseků cDNA pomocí PCR s kombinací primerů genově specifického
(GSP) a komplementárního k výše připojenému RNA primeru (pro 5’ oblast cDNA) nebo
genově specifického a oligo da (pro 3’ oblast cDNA). Spojením obou PCR produktů je
moţné připravit cDNA kódující kompletní rekombinantní protein a identifikovat
kompletní 5’ a 3’ nepřekládané oblasti mRNA (Obr. 2.13). Pro dosaţení maximální
přesnosti je nutné pouţít přesnou DNA polymerasu s opravnou funkcí, takzvanou
proofreading. Tato metoda vyţaduje znalost aspoň krátkého úseku cDNA umoţňujícího
navrhnout vnitřní primery.
Alternativně je moţné získat 5’ koncovou oblast mRNA pomocí reverzní
transkripce mRNA s pouţitím sekvenčně specifického primeru, po níţ je k 3’ konci
vzniklé cDNA připojen netemplátový oligo dC pomocí terminální deoxyribonukleotidyl
transferasy (TdT). Tento oligo dC společně se sekvenčně specifickým primerem
umoţňuje namnoţit DNA fragment odpovídající 5’ oblasti mRNA. Metoda je vhodná pro
identifikaci 5’ konců i minoritních mRNA.
V úvodní kapitole byla zmíněna kodonová optimalizace (CUO) cDNA za účelem
dosaţení vyšší produkce proteinu přizpůsobením četnosti tripletů organismu, v němţ
bude rekombinantní gen syntetizován. Níţe je uvedený příklad provedené optimalizace
DNA kódující cystein dioxygenasu houby Trichophyton mentagrophytes pro expresi
42
v lidských
CHO
buňkách.
K analýze
byl
pouţit
server
http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/
a
databáze
pouţívaných
kodonů
http://www.kazusa.or.jp/codon/. Výsledek naznačuje, ţe pokud bychom chtěli
exprimovat s maximální účinností tento protein v CHO, museli bychom připravit cDNA
synteticky. První část ukazuje přehled nutných záměn tripletů mezi T. mentagrophytes a
lidskými CHO buňkami. V druhé části je ukázán příklad situace na úrovni cDNA
nukleotidů (Tab. 2.10).
Obrázek 2.13. Příprava mRNA plné délky pomocí GeneRacer (Invitrogen)
43
Tabulka 2.10. CUO T. mentagrophytes (query) a lidské (optimized) cDNA
44
Techniky izolace známého genu a cDNA (PCR, RT-PCR, RACE)
Nukleové kyseliny jsou přítomny v různých buněčných kompartmentech – jádro,
mitochondrie, cytoplasma. Postupy izolace DNA a RNA mohou respektovat tuto
kompartmentaci a izolovat nukleovou kyselinu specificky obsaţenou v některém z nich,
nebo umoţňují izolovat DNA nebo RNA obsaţenou v celé buňce. Zde se budeme
věnovat izolaci celkové genomické DNA, celkové RNA a mRNA.
Při izolaci jakékoliv nukleové kyseliny je třeba volit metodu v závislosti na
poţadované čistotě a mnoţství finální NK a na typu buněk, z nichţ má být NK izolována.
Pro naprostou většinu následných aplikací (zejména enzymatických) je výhodnější
dosáhnout vyšší kvality třeba i na úkor celkového mnoţství NK, neboť pro metody jako
45
je PCR, reverzní transkripce a ligace jsou i submikro- a subnanogramová mnoţství
vysoce kvalitní NK dostačující.
První krok při izolaci NK spočívá v uvolnění NK z buňky pomocí vhodného
pufru a následné selektivní izolaci NK, respektive selektivním odstraněním ostatních
buněčných komponent. Uvolnění NK z buňky znamená prakticky dezintegraci buněčné
membrány, případně buněčné stěny, případně dalších buněčných obalů. Toto můţe být
realizováno pomocí detergentů a jiných fyzikálně-chemických postupů. Jiný přístup
k dezintegraci zejména tkání a buněčné stěny jsou fyzikálně-chemické neenzymatické
postupy. Zejména pro organismy se silnou polysacharidovou stěnou je vhodné pouţít
v úvodu izolace fyzikální postupy dezintegrace této stěny zaloţené na působení tření
(tření v třecí misce, Potter-Elvehjem homogenizátor, mlýny), na působení nárazu buňky
na pevnou stěnu společně s vysokou turbulencí prostředí (odstředivé dezintegrátory) a na
rychlých změnách tlaku a působení varu. Fyzikální metody se aplikují na buňky umístěné
v pufrech obsahujících kombinaci detergentů (Triton X100, NP-40), které rozpouštějí
buněčné membrány, zásad (NaOH – denaturuje DNA, z níţ kovalentně uzavřená
plasmidová DNA můţe být snadno renaturována při neutrálním pH) a činidel
denaturujících proteiny (SDS, guanidin thiokyanát). Z detergentů, například neionogenní
NP-40, je moţné pouţít k rozpuštění buněčné membrány při zachování jaderné
membrány, coţ umoţní separovat jadernou NK od cytoplasmatické NK. Metody izolace
DNA se často doplňují o krok, který specificky eliminuje kontaminující RNA (jeţ se při
purifikaci chová podobně jako DNA) přidáním ribonukleasy A do startovního pufru.
RNasaA jako většina RNas je značně odolný enzym a alkalické lyzační prostředí pro ni
není nebezpečné.
Aplikací kombinace jednotlivých výše uvedených činidel je moţné získat NK
v rozpustné formě spolu s dalšími buněčnými sloţkami, které je ovšem pro optimální
fungování naprosté většiny následných, zejména enzymatických, reakcí a pro poţadavek
dostatečné stability NK v průběhu času nutné odstranit. V tomto kroku je moţné pouţít
několik přístupů. Jeden z nejstarších, ale stále široce pouţívaných postupů je extrakce
proteinové sloţky hrubého lyzátu fenolem. Jedná se o extrakci ze suspenze vodného
pufru a fenolu (případně s chloroformem nebo moderněji s bromochloropropanem).
Centrifugací se tato suspenze rozdělí na vodnou fázi obsahující NK, rozhraní obsahující
část denaturovaných proteinů a fenolickou část obsahující další proteinové molekuly.
Fenolová extrakce navíc umoţňuje cílenou izolaci RNA zbavené DNA tak, ţe při pouţití
pufru a fenolu s nízkým pH (< 4) a při nízké objemové koncentraci chloroformu (do 20 %
pouţitého objemu fenolu) je DNA nerozpustná ve vodě a pouze RNA zůstává ve vodní
fázi. Další výhoda této metody spočívá v tom, ţe při pouţití silného deteregentu, jakým je
například guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid, je buněčný obsah včetně NK
v počáteční bifázické suspenzi (před přidáním chloroformu) stabilní po velmi dlouhou
dobu, jestliţe je uchován při –80 °C, coţ je zejména vhodné pro snadné prvotní
zpracování velkého mnoţství v čase se průběţně kumulujících vzorků, jejichţ finální
46
analýza je provedena aţ po relativně dlouhé době. Další výhoda spočívá v moţnosti
izolovat z jednoho takto uskladněného vzorku, zvlášť DNA, RNA nebo proteiny.
Komerčně jsou dostupné kity obsahující pouze jeden roztok sloţený ze směsi
denaturačního pufru a stabilizovaného fenolu, jeţ jsou přímo pouţitelné k uchování a
následné izolaci NK bez nutnosti míchat jednotlivé reagencie dohromady (IzogenNippon Gene, RNA-Stat 60 – Tel-Test, RNAzol B – Cinna Scientific, Tri-Pure Isolation
Reagent – Boehringer Mannheim, TRI Reagent – Molecular Research Center, TRIzol
Reagent – Life Technologies apod.).
DNA nebo RNA obsaţená ve vodní fázi izolované výše uvedenými metodami je
následně purifikována od kontaminujících solí precipitací DNA pomocí isopropanolu
nebo etanolu. NK vypadává z roztoku. Soli zůstávají rozpuštěné v pufru a je moţné je
oddělit od pelety. Precipitovaná NK se opakovaně promývá v 70% etanolu a poté se
vysuší a rozpustí buď ve vodě, nebo pufru s pH mezi 7–8 pro DNA nebo ve vodě pro
RNA. Alternativní postup závěrečného přečištění NK spočívá ve vyuţití
chromatografických kolon, kterých je v současnosti na trhu obrovské mnoţství. Základní
výhoda kolon spočívá v moţnosti selektivní eluce NK o určité velikosti, coţ je dáno
pouţitým pH a iontovou silou promývacích a elučních pufrů. Vzhledem k tomu, ţe při
eluci NK se pouţívá poměrně vysoká koncentrace solí, následuje po eluci NK opět
precipitace výše uvedeným EtOH nebo isopropanolem. Precipitace se vypouští v případě
tzv. minipreparací, které slouţí k izolaci malého mnoţství NK, kde je účinnost
precipitace příliš nízká.
Podobně jako ionexy umoţňují separovat jednotlivé typy NK, separace
genomické DNA, plasmidové DNA a RNA je moţná i pomocí ultracentrifugace
v gradientu CsCl (Obr. 2.14). Pro zvýšení efektivity separace se před centrifugací
přidává do roztoku interkalační činidlo etidium bromid, který je nutné po centrifugaci
odstranit odmýváním například n-butanolem nebo pomocí chromatografické kolony.
Horní fáze odpovídá genomické DNA, prostřední fáze, kam míří jehla, odpovídá
plasmidové DNA a peleta je tvořena RNA.
Obrázek 2.14. Ultracentrifugační frakcionace plasmidové a genomické DNA
47
Izolace genomické DNA. Zvláštnosti izolace genomické DNA spočívají zejména
v její obrovské molekulové hmotnosti, délce DNA vláken, a tedy křehkosti izolované
molekuly. Pro většinu aplikací (s výjimkou přípravy genomických knihoven) však zlomy
DNA vlákna neovlivní efektivitu následných metod, neboť zlomy jsou lokalizovány na
DNA vláknu náhodně a vţdy jsou po izolaci získány i fragmenty, na nichţ je kontinuální
úsek, který obsahuje sekvenci, jeţ je cílem našeho zájmu. Obecně však lze říci, ţe čím je
metoda jednodušší z pohledu mechanické manipulace s DNA, tím je výsledná délka
DNA vláken větší. Při izolaci genomické DNA se nejčastěji vyuţívá úvodní dezintegrace
materiálu v třecí misce za nízkých teplot (v tekutém dusíku je teplota –196°C) nebo lze
pouţít enzymatické štěpení mezibuněčné pojivové hmoty pomocí enzymatického štěpení.
Následuje rozpuštění buněčných membrán a denaturace proteinů pomocí ionogenního
detergentu (SDS, sarcosyl) a štěpení proteinů proteinasou K, která se nechává působit
přes noc při 37–50°C. Pro ochranu DNA se přidává do lyzačního pufru EDTA, která váţe
ionty, jeţ jsou nezbytnými kofaktory DNas. Druhý den se DNA extrahuje opět fenolovou
metodou nebo je moţné pouţít solnou extrakci proteinů pomocí NaCl ve výsledné
koncentraci 2,2 M. Následuje precipitace etanolem, nebo isopropanolem, umoţňující
koncentrovat DNA a odstranit většinu solí. Při izolaci genomické DNA z materiálu
s vysokým obsahem polysacharidů (rostliny, houby) je moţné selektivně precipitovat
DNA pomocí CTAB.
Izolace RNA. Samostatnou kapitolu tvoří metody pro izolaci RNA. Jako kaţdou
jinou NK je moţné i RNA izolovat výše uvedenými metodami. Hlavní rozdíl však
spočívá v nutnosti postupovat tak, aby nedošlo k degradaci RNA všudypřítomnými
RNasami, které jsou značně odolné vůči teplotě, detergentům a nevyţadují pro svou
aktivitu ţádné kofaktory. Hlavním zdrojem RNas je samozřejmě izolovaný vzorek. Zde
však je degradaci moţné předejít pouţitím nízké teploty během zpracování vzorku před
48
umístěním do lyzačního pufru. Lyzační pufry jsou většinou sloţeny z chaotropních
činidel (guanidium chlorid, guanidium isothyokyanát), která RNasy inaktivují. Další
nebezpečí degradace RNA tedy následuje aţ po odstranění těchto pufrů, tedy ve fázi
precipitace RNA etanolem nebo isopropanolem. Po precipitaci je RNA peleta rozpuštěna
ve vhodném pufru nebo v deionizované vodě a tyto musí být prosté RNas, neboť jinak
hrozí nebezpečí degradace finálního produktu a znehodnocení celého izolačního postupu.
Během další manipulace s izolovanou RNA je nutné zabránit moţné kontaminaci vzorku
RNasami, jejichţ zdrojem jsou ruce experimentátora, bakteriální kontaminace roztoků a
laboratorního materiálu. Ošetření laboratorního materiálu umoţňujícího degradovat
RNasy spočívá v ţíhání skleněných pomůcek za vysoké teploty (180°C po 8 hod), nebo
ošetření pomůcek chloroformem. Odstranění RNas z vody je moţné přidáním
dietylpyrokarbonátu, jenţ musí působit přes noc a poté se degraduje autoklávováním.
Povrchy laboratorních přístrojů a pracovních ploch je moţné ošetřit speciálními
detergenty ničícími RNas (RNseZAP Sigma). Samozřejmostí je nošení ochranných
rukavic, dodrţování čistoty, minimalizace času při zpracování vzorku a hlavně vyuţívání
plastu na jedno pouţití, který je certifikován jako RNas prostý.
Reverzní transkripce umoţňuje přepis RNA do podoby komplementární DNA
(cDNA). Při izolaci genu pro produkci rekombinantních proteinů se provádí reverzní
transkripce mRNA pomocí oligo dT primeru, který umoţní selektivní přepis pouze
mRNA a enzymu reverzní transkriptasy. V současnosti jsou k dispozici různé modifikace
reverzní transkriptasy nejčastěji odvozené z moloneyového viru myší leukémie (MMLV)
nebo viru ptačí myeloblastózy (AMV), připravených rekombinantní technologií.
Modifikace se týkají a) zvýšení stability enzymu při vyšších teplotách, vedoucí k vyšší
specificitě a rychlosti reakce, b) eliminace aktivity RNasyH, která štípe RNA ve
vznikajícím heteroduplexu RNA/cDNA a omezuje maximální délku cDNA. Vzniklá
cDNA je potom templátem pro amplifikaci genu například pomocí PCR. cDNA můţeme
skladovat dlouhodobě, neboť je mnohem stabilnější neţ RNA. Další moţnost je vnesení
cDNA do klonovacího plasmidu a uchování v podobě transformovaných
rekombinovaných E. coli.
PCR se většinou provádí bezprostředně po reverzní transkripci. K dosaţení
maximální přesnosti se pouţívá polymerasa s proofreading aktivitou, coţ znamená, ţe
kromě vlastní DNA polymerázové reakce enzym provádí i exonuklasovou 3’ → 5’
opravnou kontrolu správnosti párování nukleotidů. Tím je dosaţeno poklesu chyb o
několik řádů, coţ je významné pro izolaci bezchybné cDNA. S 3’ → 5’ exonukleázovou
aktivitou souvisí i to, zda DNA polymerasa vytváří jako produkt amplifikace
dvouvláknovou DNA končící tupě (proofreading polymerasy), nebo s přesahující dA na
3’ konci (Taq polymerasa). To je rozhodující pro volbu klonovacího plasmidu, do kterého
bude PCR produkt vnesen v případě, ţe pouţijeme plasmid pro přímé vnášení PCR
produktů. Dostupné jsou obě varianty, ale je nutné ověřit, jakou pro klonování
potřebujeme. Druhý významný faktor pouţité DNA polymerasy je její procesivita, tedy
49
schopnost číst templátovou DNA určité délky. Čím je větší procesivita polymerasy, tím je
moţné amplifikovat delší úseky cDNA. Poslední významný faktor je, zda je polymerasa
schopná amplifikovat templáty s vysokým obsahem g/c nukleotidů. Jedná se do značné
míry o kompatibilitu polymerasy s pufrem modifikovaným pro g/c templáty. Jednotlivé
parametry ovšem vylučují jiné, a proto je nutné vţdy volit na základě zvolené priority.
Příkladem je nabídka firmy New England Biolabs (Obr. 2.15)
Obrázek 2.15. Souvislost různých parametrů polymeras pro PCR
50
Práce s genovými a proteinovými databázemi
Současný mohutný rozvoj informačních technologií umoţnil vytvoření genových
a proteinových databází, které jsou vzájemně propojeny, takţe vyhledávání a srovnávání
popsaných genů a proteinů je relativně velmi snadné. Do databází jsou většinou vkládány
výsledky sekvenace genomické DNA nebo cDNA získané reverzní transkripcí mRNA.
Proteinové sekvence jsou naopak velmi často výsledkem nikoliv přímého sekvenování
izolovaných proteinů, ale výsledkem přepisu cDNA sekvence do aminokyselinové
sekvence in silico, tedy pomocí počítače. Dále jsou dostupné databáze fragmentů
exprimovaných sekvencí (database of expressed sequence Tags – dbEST), které
usnadňují lokalizaci exonů na genomické DNA úrovni. Propojení různých databází je
moţné demonstrovat na schématu sekcí národního centra pro biotechnologické informace
(NCBI) Národního institutu zdraví USA (NIH) (Obr. 2.16).
Obrázek 2.16. Schéma vzájemného provázání databází NCBI NIH
51
Klonovací a expresní plasmidy
Vnášení DNA do plasmidu je moţné několika způsoby. Klasický způsob spočívá
v ligaci DNA do plasmidu pomocí DNA ligasy (Obr. 2.17). Jinou moţností je vnášení
PCR produktů buď běţnou ligační reakcí, nebo přímým klonováním PCR produktů do
linearizovaných plasmidů aktivovaných topoizomerasou I (Obr. 2.18). Jiná moţnost je
přenos DNA fragmentu z jednoho plasmidu do druhého místně specifickou rekombinací,
jako je tomu například u systému Gateway od firmy Invitrogen (Obr. 2.19).
Obrázek 2.17. Plasmid s MCS pro ligaci DNA insertu DNA ligasovou reakcí
52
Obrázek 2.18. Plasmid pro jednosměrné PCR klonování
53
Místně specifická rekombinace u systému Gateway je odvozená od místně
specifické rekombinace probíhající u lambda fága. Rekombinace je katalyzována
enzymovou směsí označovanou jako klonasa II, která rozlišuje signální sekvence attL1 a
attL2 v donorovém plasmidu, vyštípne úsek DNA mezi nimi a liguje jej mezi signální
sekvence attR1 a attR2 akceptorového plasmidu.
Obrázek 2.19. Gateway pro místně specifickou rekombinaci (Invitrogen)
54
Základní technika klonování (restrikce – ligace)
Restrikce DNA. Analýza DNA pomocí restrikčních endonukleas. Restrikční
endonukleasy byly poprvé popsány u bakterií v souvislosti se schopností bakterií
odolávat infekci DNA viry. Restrikční endonukleasy tvoří velmi širokou rodinu proteinů,
jeţ svou velikostí variují od 157 aa (PvuII) aţ do 1250 (CjeI) a více. Z hlediska
praktického vyuţití, zejména při analýze DNA a rovněţ při klonování, je třeba
připomenout několik základních pojmů. Izoschisomery se označují všechny restriktasy,
které rozlišují stejnou sekvenci DNA. Rozlišovaná DNA sekvence vykazuje často
symetrii. Palindrom je úsek dvouřetězcové DNA, jehoţ pořadí bází je v obou vláknech
totoţné při protisměrném čtení. Mnoho restrikčních endonukleas štěpí DNA sekvenci,
která má vlastnosti palindromu. Jiné restriktasy naopak štípou sekvenci, která není
palindromem. Mnohé z takových restriktas štípou mimo rozlišovanou sekvenci
(definovaný počet nukleotidů dále), coţ je moţné s výhodou vyuţít při klonování DNA.
Restrikční místo přidáme k izolované sekvenci například prostřednictvím PCR primerů
na jejich 5’konec, a tedy vně klonované sekvence. Produkt PCR klonujeme k další DNA
po restrikci enzymem (např. BbsI), jeţ rozliší příslušnou sekvenci, ale štípe mimo ni, a to
směrem do amplifikované DNA (Tab. 2.11).
55
Tabulka 2.11. Klonování bez vnesení restrikčního místa do cílové sekvence
GAAGACTT
CTTCTGAAGCCG
CGGCGCC TGG TTC CCC CTT TTC
GAAGACCC
CGG ACC AAG GGG GAA AAG
CTTCTGGGCGGC
upstream primer 5’ klonované sekvence
GCC GAG AAG CTG T
TC TTC GAC A
downstream primer 3’ klonované sekvence
NNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAGGGGGAACCAGGCGCCGAAGTCTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTTCCCCCTTGGTCCGCGGCTTCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
spojení mezi 5’DNA úsekem a 3’DNA úsekem
Sekvence rozlišovaná restriktasou BbsI, sekvence oddělující místo rozlišované
BbsI a štípané BbsI, 3’konec DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5’konci
(odpovídá například N’ terminální části fúzního proteinu), sekvence 5’konce DNA
fragmentu lokalizovaného směrem k 5’konci (odpovídá například C’terminální části
fúzního proteinu).
Kromě výše uvedených restrikčních endonukleas se vyuţívají specifické
exonukleasy a restriktasy, které štípou specificky jednovláknovou DNA, jednovláknovou
RNA nebo RNA v hybridu s DNA atd.
Minipreparace a maxipreparace DNA
Preparace plasmidové DNA. V jednotlivých krocích klonování je nutné získat
čistou plasmidovou DNA pro další postupy. Prvním krokem je tedy izolace plasmidové
DNA, která můţe být provedena jako mikropreparační metoda (mnoţství získané DNA
dosahuje 20 g), například pro následnou PCR analýzu nebo následné PCR klonování,
midipreparační metoda (mnoţství získané DNA dosahuje 500 g) pouţitelná pro všechny
standardní postupy, zejména ligaci fragmentů DNA získaných restrikcí specifickými
endonukleasami. Maxi a mega preparativní postupy (mnoţství získané DNA dosahuje 5 ÷
10 mg) umoţňují připravit DNA například pro DNA vakcinaci, kde dávky na jednu
experimentální imunizaci dosahují 10 ÷ 100 g pro malá laboratorní zvířata a aţ 8 mg
pro člověka.
Pro izolaci plasmidové DNA je moţné, podobně jako při izolaci genomické DNA,
pouţit 1) ultracentrifugační frakcionaci celkové nukleové kyseliny na genomickou DNA,
plasmidovou DNA a RNA, 2) purifikaci plasmidové DNA od níţ je genomická DNA
odseparována pomocí inotoměniče, nebo 3) separaci plasmidové DNA od genomické
56
DNA po precipitaci celkové DNA pomocí rozdílné rozpustnosti plasmidové a genomické
DNA.
Většina procedur pro purifikaci plasmidové DNA je zaloţena na metodě alkalické
hydrolýzy. Spočívá v separaci buněk od kultivačního média, resuspendování buněčné
pelety v Tris-Cl pufru s glukózou a EDTA a následné alkalické lýze, kdy je buňka
lyzována a proteiny s DNA jsou denaturovány pomocí SDS a NaOH. Následuje
vysráţení SDS s vysokomolekulární DNA a denaturovanými proteiny prostřednictvím
octanu draselného. Kovalentně uzavřené plasmidy renaturují a zůstávají rozpuštěny v
pufru. Precipitát je následně odstraněn centrifugací nebo filtrací a izolovaná plasmidová
DNA (rozpuštěná v supernatantu) je precipitována isopropanolem nebo purifikována na
iontoměničové koloně. Po eluci je DNA rozpuštěna v pufru s optimálním pH 8 (například
Tris-Cl). Do pufru je moţné přidat EDTA, která odebráním iontů kovů inaktivuje DNA.
Purifikace pomocí iontově výměnné chromatografie umoţňuje volbou vhodné
koncentrace NaCl během promývání a eluce separovat jednotlivé druhy nukleových
kyselin (Obr. 2.20).
Obrázek 2.20. Eluce jednotlivých NK podle koncentrace NaCl
Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu.
Agarosový gel umoţňuje separovat nukleové kyseliny o délce od 50 nukleotidů
do 2.106 nukleotidů. Standardní agarosová elektroforéza separuje optimálně fragmenty
dvouvláknové DNA o velikosti 50 aţ 25 000 párů bází. Optimální rozlišení v určitém
57
rozsahu velikostí DNA a RNA je moţné dosáhnout volbou koncentrace agarosy
v připraveném separačním gelu (Tab. 2.12, Tab. 2.13, Obr. 2.21).
Tabulka 2.12. Optimální dělící podmínky pro agarosovou elektroforézu
Délka fragmentů DNA [kb]
1–30
0,8–12
0,5–10
0,4–7
0,2–3
Optimální koncentrace agarosy [%]
0,5
0,7
1,0
1,2
1,5
Pro separaci se pouţívá acetátový nebo borátový pufr. DNA se v elektrickém poli
při pH 8 pohybuje jako záporně nabitá molekula ke kladně nabité elektrodě – anodě.
Intenzita separačního napětí bývá 1–5 V/cm vzdálenosti připojených elektrod. Rozdíly ve
struktuře DNA molekuly ovlivňují významně pohyblivost DNA. Pro vizualizaci DNA se
pouţívá interkalační činidlo ethidium bromid (EtBr), který je aktivován pomocí
ultrafialového světla a emituje světlo v oblasti oranţové barvy (610 nm). Ethidium
bromid je silný mutagen a suspektní karcinogen. Detekční mez při pouţití EtBr je dána
velikostí DNA fragmentů a nemá lineární závislost. V průměru dosahuje asi 2 ÷ 5 ng
DNA na jeden diskrétní 5 mm dlouhý prouţek. Při analýze genomické DNA je tedy
nutné pouţít mnohonásobně vyšší mnoţství DNA 20 ÷ 30 g na 5mm dlouhou jamku.
EtBr ovlivňuje i pohyblivost jednotlivých forem DNA šroubovice. Ethidium bromid svou
interkalací do DNA ruší negativní suprahelikální strukturu formy I DNA a po překročení
kritické hodnoty koncentrace volného EtBr „free-dye concentration“ (0,1 ÷ 0,5 g/ml)
dochází k tvorbě kladné suprahelikální struktury u formy I DNA. Tak pohyblivost od
negativního superhelixu přes prostou cirkulární DNA k pozitivnímu superhelixu nejdříve
klesá a potom opět roste. U forem II a III interkalace EtBr do struktury způsobuje
prodlouţení DNA molekuly a vzrůst rigidity, čímţ můţe pohyblivost pouze klesat, a to aţ
o 15 %.
Tabulka 2.13. Morfologie a pohyblivost DNA na agarosovém gelu
Forma
Morfologie
Pohyblivost
I
Suprahelix. Negativní → relaxovaná → pozitiv.
Nejvyšší → nízká → nejvyšší
II
Prostá (zářezy) cirkulární
Nízká
III
Lineární dvojvlákno
Vysoká
58
Obrázek 2.21. Závislost pohyblivosti DNA na její morfologii
Pro separaci vysokomolekulární DNA je nutné pouţít PFE (elektroforéza v
pulsním elektrickém poli) nebo chef (contour clamped homogenous electric field =
homogenní elektrické pole zaloţené na řízené rotaci polarit přilehlých elektrod).
Malé DNA fragmenty a malé rozdíly délky DNA molekuly je moţné analyzovat
v polyakrylamidovém gelu s borátovým pufrem. Tyto gely se pouţívají jednak pro
separaci oligonukleotidů, jednak pro sekvenační účely. Na rozdíl od standardního
agarosového gelu probíhá separace DNA v akrylamidovém gelu velmi pomalu.
Standardní agarosová elektroforéza není vhodná ani pro separaci RNA. Tuto je
nutné dělit v agarosovém gelu za denaturačních podmínek, tedy v pufru obsahujícím
nejčastěji 7 % formamidu. RNA vzorek v nanášecím pufru obsahujícím ústoj,
formaldehyd a formamid je nutné před nasazením do gelu denaturovat 15 min při 55°C.
Po separaci RNA je nutné před vizualizací ethidium bromidem odmýt nejdříve
59
formaldehyd z agarosového gelu pomocí 0,5M octanu amonného. Typickým znakem
kvalitní celkové RNA je přítomnost dvou prouţků odpovídajících ribozomální RNA.
Naopak typickým znakem kvalitní izolace mRNA z celkové RNA je úbytek intenzity
obou prouţků na úkor zvýšeného smíru mRNA pokrývajícího oblast 500 aţ 4 000
nukleotidů.
Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální, rekombinace do genomu
Zajištění trvalé přítomnosti plasmidu v hostitelské buňce je většinou realizováno
pomocí selekčního tlaku antibiotik. Tato metoda je efektivní a také nejsnadnější. Expresi
vneseného genu kódujícího rekombinantní protein či fenotypový znak buňky vázaný na
expresi či naopak blokování exprese určitého proteinu je moţné zajistit stabilní integrací
do odpovídajícího místa chromozomu hostitelské buňky. Inaktivace určitého buněčného
genu je nejlépe realizovatelná homologní rekombinací STOP kazety do oblasti genu.
V případě izolace kyseliny hyaluronové z kmene Streptococcus equi subsp.
zooepidemicus, pouţité jako modelový problém praktické části kurzu, byla pouţita
homologní rekombinace kazety nesoucí gen rezistence k inaktivaci genu pro glukuronidasu.
Vnesení plasmidů do buněk – transformace
V průběhu buněčného klonování je nutné dopravit DNA konstrukt (plasmid) do
buňky, kde je následně replikován a v případě expresního plasmidu dochází k regulované
expresi rekombinantního proteinu. Vnesení DNA do prokaryontní buňky se označuje
transformace, vnesení DNA do eukaryontní buňky se nazývá transfekce. Pro vnášení
DNA do buňky jsou k dispozici různé metody, a to fyzikální, chemické nebo biologické.
Chemická transformace – principy, příprava kompetentních buněk
Chemická transformace E. coli je metoda velmi efektivní, a proto se standardně
pouţívá v mnoha laboratořích. Její výhoda mimo jiné spočívá v nízkých nákladech na
provedení vlastní transformace, neboť kromě vyhřívané lázně nebo aspoň kádinky
s vodou o teplotě 42°C není nutný ţádný zvláštní přístroj. Metody se nazývají podle
způsobu přípravy takzvaně kompetentních buněk, tedy bakterií připravených k následné
transformaci, která se provádí tak, ţe se přidá DNA k chemicky kompetentím buňkám a
po krátké inkubaci, kdy dochází k adhezi DNA na povrch buněk, je proveden tepelný šok
(42°C, 30 – 90 s), během něhoţ DNA vstupuje do buňky. Následuje preinkubace buněk
60
v SOC médiu (37°C, 1 hod.) a vyočkování na tuhé (agarové) selekční půdy. Podobným
způsobem probíhá druhý typ chemické transformace, kdy jsou kompetentní buňky
připraveny inkubací v roztoku chloridu rubidného. Obě metody umoţňují připravit
kompetentní bakterie do zásoby předem a uchovat je dlouhodobě v -80°C.
Pro transfekci DNA do savčích buněk je moţno pouţít metody s DEAE
dextranem nebo transfekci za tvorby komplexu DNA a fosforečnanu vápenatého .
V současnosti se stále více vyuţívají kationické liposomy a kationické polymery, jako
například polyethylenimin. Tyto jsou dodávány komerčně pod různými názvy a efektivita
transfekce závisí zejména na pouţité buněčné linii a kvalitě kultury v době transfekce
(ţivotnost buněk, stáří).
Elektroporace – princip, příprava kompetentních buněk, podmínky
Elektroporace je metodou volby v případech, kdy chemické metody transformace
bakterií či transfekce eukaryontních buněk nedosahují dostatečné efektivity. Princip
elektroporace spočívá v dočasné destabilizaci buněčné membrány, navozené elektrickým
pulsem. V případě bakterií se i zde vyuţívá moţnost připravit kompetentní bakterie
předem, a to promýváním bakteriální suspenze ve sterilní vodě při teplotě tání ledu.
Uchování kompetentních bakterií se provádí v 10% vodném roztoku glycerolu při –80°C.
Podmínky elektroporace jsou optimalizované pro různé bakteriální druhy a spočívají
v elektrickém pulsu provedeném přes elektroporační kyvetu, v níţ jsou kompetentní
buňky s DNA umístěny. Volitelné podmínky elektroporace jsou: koncentrace buněk,
mnoţství DNA, druh elektroporační kyvety, elektrické napětí, kapacita, případně odpor a
průběh pulsu. Pro E. coli je moţné pouţít tyto podmínky – peleta z 25 ml bakteriální
kultury O.D.600 = 0,3; 10 pg DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,1 cm štěrbina;
25 F; 1800 V; 200 Ω. Transfekční účinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli
na 1 g DNA. K elektroporaci je nutné pouţít elektroporátor, coţ je zařízení, jehoţ
pořizovací náklady jsou ve stovkách tisíců korun. Příklad elektroporátoru od firmy Bio
Rrad je uveden na Obr. 2.22.
Obrázek 2.22. Elektroporátor pro vnášení DNA do bakterií i savčích buněk
61
Pro elektroporaci eukaryontních buněk jsou rovněţ dostupné protokoly nastavení
elektrických vlastností pulsu. Buňky se k elktroporaci připravují těsně před vlastním
pulsem. Buňky nejsou promývány vodou jako u E. coli, ale pomocí vhodného pufru nebo
kultivačním médiem. Příklady pouţívaných pufrů pro přípravu savčích buněk
k elektroporaci jsou následující: RPMI 1640; RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM
dithiothreitol; 1 x PBS; 15 mM HEPES pufr; elektroporační pufr 272 mM sacharóza,
7 mM fosfát sodný, pH 7,4, 1 mM MgCl2; pufr o sloţení 50 mM K2HPO4, 20 mM
CH3CO2K, 20 mM KOH, pH 7,4; hypoosmolární elektroporační pufr (Eppendorf).
Elektrické parametry pulsu závisí na pouţité buněčné linii a i pro jednu linii je
publikováno poměrně velké rozpětí hodnot, které jednotlivé laboratoře experimentálně
ověřily jako optimální. Jako příklad uveďme elektroporaci monocytární linie U937 – 0,3
ml buněčné suspenze 1,3x107/ml ţivých buněk 10 g DNA; předchlazené elektroporační
kyvety 0,4cm štěrbina; elektrické podmínky viz Obr. 2.23. K elektroporaci bylo pouţito
10 g plasmidu pSIV LTR/CAT kódujícího bakteriální chloramfenikolacetyltranferázu
(CAT) pod kontrolou LTR promotoru (CAT byla pouţita k monitorování transfekční
účinnosti) a 15 g pSV/tat plasmidu kódujícího Tat protein, který aktivuje transkripci
genu kontrolovaných LTR. Aktivita CAT byla měřena radioaktivní metodou stanovující
radioaktivitu reakčního produktu po inkubaci s buněčným lyzátem (obsahujícím
syntetizovanou CAT).
Obrázek 2.23. Podmínky elektroporace lidské monocytární linie U937
62
Stabilita plasmidů v buňkách
Po vnesení plasmidu do bakterie je nutno udrţovat selekční tlak, který zabrání
bakterii, aby plasmid vyloučila z buňky. Nejvhodnější je pouţití antibiotik, jejichţ
eliminace je zajištěna proteinem kódovaným pomocným genem v klonovacím nebo
expresním plasmidu.
Jinou moţností je integrace plasmidové DNA do genomu hostitelské buňky, a to buď
náhodně (pouţíváno při selekci stabilně transferovaných klonů savčích buněčných linií),
nebo homologní rekombinací (pouţíváno i u prokaryot). Homologní rekombinace vţdy
nahradí určitý, přesně vymezený úsek genomické DNA. Vnesený gen můţe kódovat buď
jen selekční marker (rezistence na antibiotikum), nebo jiný protein zajišťující novou
fenotypovou vlastnost buňky, nebo můţe být cílem pouze inaktivace nahrazeného úseku
genomické DNA, coţ bude v praktické části projektu pouţito k inaktivaci genu
kódujícího -glukuronidasu v linii Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.
Episomální DNA
Episomální DNA se pouţívá zejména pro zajištění nového fenotypového znaku
hostitelské bakteriální linie. Detaily byly diskutovány výše.
Antibiotická selekce
Antibiotika jsou stále nejčastěji pouţívaným selekčním markerem při
molekulárním klonování. Některé obecné aspekty byly jiţ zmíněny v předcházejících
kapitolách. Zde jen několik praktických poznámek. Pouţití antibiotika jako ampicilin je
63
spojeno s fenoménem satelitních kolonií. Jedná se o to, ţe po naočkování bakterií na
pevné selekční půdy s ampicilinem začnou nejdříve růst pouze bakterie, které nesou
plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin (Obr. 2.24).
Obrázek 2.24. Satelitní kolonie při kultivaci na tuhých půdách s ampicilinem
Po několika hodinách se však v okolí kolonií objeví další malé „satelitní“ kolonie
bakterií, které však nenesou plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin. Na obrázku jsou
šipkami označeny centrální kolonie, kolem kterých se satelitní kolonie vytvářejí.
Ampicilin je totiţ v okolí velké kolonie rychle hydrolyzován, a satelitní kolonie jsou tedy
projevem růstu bakterií na neselekční půdě. Proto je třeba klást důraz na pouţití čerstvých
antibiotik. V případě ampicilinu je moţno redukovat kontaminaci vybraného klonu
satelitně rostoucími bakteriemi rozočkováním klonu kličkou na čerstvou selekční půdu.
64
Homologní rekombinace
Homologní rekombinace je postup cíleného nahrazení úseku genomické DNA
nejlépe pomocí lineární DNA, jejíţ okrajové části mají vysokou sekvenční homologii s
okrajem nahrazeného úseku. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat
či odstranit (gene knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene
knock-in). U bakterií dochází k homologní rekombinaci v důsledku aktivity RecA
systému. V savčích buňkách a u kvasinek dochází k homologní rekombinaci v důsledku
aktivity mis-match repair systému. U savčích buněk se však většina vloţené DNA začlení
náhodně (nikoliv sekvenčně specificky). Homologní rekombinace nastává v 1 – 0,01 %
případů z celkového počtu prokázaných rekombinací. Tím je vyuţití homologní
rekombinace u savčích buněk značně omezeno. Uţitečným pomocníkem můţe být
například reporterový gen, který správnou rekombinací umoţní detekovat a klon následně
izolovat. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat či odstranit (gene
knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene knock-in).
Ověření exprese genů na laboratorní úrovni
Fenotypová analýza, PCR analýza
Přípravou rekombinovaného expresního plasmidu a jeho vnesením do hostitelské
buňky začíná další významný krok přípravy rekombinantního proteinu, ověření produkce
a optimalizace podmínek exprese a purifikace. První skríning je moţné provést analýzou
buněčného lyzátu, například pomocí western blot analýzy. Zde je moţné s výhodou
pouţít protilátky proti různým tagům neboli krátkým peptidům, s nimiţ je rekombinantní
protein fúzován po vnesení do expresního plasmidu. Tyto krátké sekvence jsou součástí
většiny komerčně dodávaných plasmidů a nacházejí se bezprostředně před nebo za
klonovacím místem (MCS) nebo místem pro vnášení cDNA fragmentu získaného PCR
amplifikací. Aby byla tato krátká sekvence přepisována do sekvence aminokyselin, musí
být, cDNA inzert vnesen do MCS nebo odpovídajícího PCR klonovacího místa se
zachováním čtecího rámce (viz výše). Pokud se jedná o sekretované proteiny, je moţné
provádět skríning přímo ze supernatantu kultury. Bliţší popis biochemických
analytických metod je uveden v poslední kapitole.
V některých situacích, zejména u eukaryontních expresních systémů se můţeme
setkat s problémem nízké míry exprese rekombinantního proteinu, coţ znesnadňuje
detekci. Zde je moţné skrínovat přítomnost rekombinantního expresního plasmidu
pomocí PCR. Tato metoda je dále vhodná pro mapování průběhu homologní
rekombinace. Pokud se jedná o náhodnou integraci do genomu hostitelské buňky, je
moţné pouţít PCR k průkazu integrace rekombinované DNA například selektivní izolací
65
genomické DNA, která pak slouţí jako templát pro PCR amplifikaci. Zde však je nutné
zahrnout kontrolu, která prokáţe, ţe templátem nebyl zbytkový plasmid, který
genomickou DNA kontaminuje.
Skríning produkce rekombinantních proteinů
Pro skríning produkce rekombinantního proteinu byl uveden jako vhodný nástroj
western blot. Jelikoţ však většinou chceme docílit maximální dosaţitelné exprese,
snaţíme se izolovat buněčný klon s maximální mírou exprese. To je významné zejména u
eukaryontních expresních systémů kvasinkových a savčích. Navíc buňky, které exprimují
rekombinantní protein, jsou oproti ostatním buňkám v nevýhodě, protoţe mají delší
buněčný cyklus a ostatní buňky se dělí rychleji a postupně dochází k přerůstání stabilních
transfektantů ostatními buňkami.
Pro skríning exprese rekombinantního proteinu jsou vhodné metody jako dot blot
či ELISA. Dot blot metoda je zaloţená na vazbě proteinu na nitrocelulózovou nebo
polyvinyliden fluoridovou membránu na zařízení dot blotter (Obr. 2.25). Výhoda metody
spočívá v jejím snadném aplikování na velké mnoţství vzorků současně tedy pro
skrínování. Po nanesení proteinu na membránu se dále postupuje identicky jako při
imunodetekci na western blotu proteinů. Jediná nevýhoda spočívá v tom, ţe dot blot
neposkytuje ţádné informace o velikosti proteinu. Tedy pokud by došlo k tomu, ţe
vybraný klon exprimuje daný rekombinantní protein, na který se váţe protilátka, budeme
na dot blotu pozorovat pozitivní reakci, coţ je kolečko odpovídající nanesenému
proteinu. Pokud však skrínováním vybereme několik kandidátních klonů, snadno
můţeme provést následující analýzu, např. SDS-PAGE s následným western blotem, čím
získáme základní informace o proteinu. Někdy se na wester blot analýze ukáţe více
prouţků, které reagují se specifickou protilátkou. Můţe to být zapříčiněno rozpadem
proteinu, který můţe probíhat intracelulárně i extracelulárně. To uţ ale spadá do oblasti
optimalizace expresních podmínek a někdy vede k nutnosti provést modifikaci struktury
proteinu tak, aby byla zabezpečena vyšší stabilita bez ztráty potřebné funkce.
Obrázek 2.25. Zařízení pro dot blot firmy BioRad
66
67
3. BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů
Základem pilotních a průmyslových biotechnologických procesů jsou kultivace a
biotransformace v bioreaktorech. Jednoduchým bioreaktorem je jakýkoli uměle
vymezený prostor, kde bioprocesy mohou probíhat. Například třepaná baňka je
jednoduchým bioreaktorem.
Bioreaktor
Bioreaktor je zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze
substrátu na jeden či více produktů. V moderním a širším slova smyslu není vţdy nutné,
aby se procesu zúčastnily buňky, i např. Enzymové biotransformační reaktory můţeme
nazvat bioreaktory.
Bioreaktory můţeme klasifikovat podle různých hledisek, ale výše zmíněná
třepaná baňka zůstává prototypem transportních procesů, které jsou pro bioproces
nezbytné (Obr. 3.1).
Obrázek 3.1. Transport živin a metabolitů.
Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance, 1. mezifázové rozhraní plyn-kapalina,
2. transport v kapalině, 3. kapalina-pevná fáze, 4. transport aglomerátem, 5. transport přes
biologické membrány.
68
Klasifikace typů bioreaktorů
Bioreaktory rozdělujeme podle různých hledisek, základní dělení je podle fáze:
 Submerzní – nositelé bioprocesu (buňky, enzymy, agregáty, imobilizáty) se volně
vznášejí v kapalné fázi ţivného média,
 Na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a nositelé bioprocesu
tvoří povlak čí nárůst; i tady se zpravidla tvoří mezistrukturní vrstvičky kapaliny,
 Imobilizované – nositelé procesu jsou nějakým způsobem ukotveni v pevné struktuře.
Obrázek 3.2. Některé typy submerzních bioreaktorů
1. mechanicky míchaný tank, 2. průtočný s nepohyblivou
náplní, 3. kombinovaný pro bioplyn, 4. enzymový
membránový, 5. pneumatický, 6. s pevnou fází
69
Jiné dělení můţe být podle objemu procesu:
Měřítko:
•
•
•
•
Laboratorní (do 30 l)
Čtvrtprovozní (do 100 l)
Poloprovozní (do 5000 l)
Provozní (nad 5000 l)
Charakter pohybu média i nositelů procesů zakládá dělení podle operačního módu:
•
•
•
Vsádkový (batch) - všechny ţiviny jsou vloţeny do procesu jiţ na počátku,
metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu,
Přítokovaný (fed-batch) – k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s
novými ţivinami, metabolity se opět hromadí,
Kontinuální – existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadrţováni, nebo odtékají.
Další základní dělení je na aerobní (za přístupu kyslíku), mikroaerobní
(minimální přístup kyslíku, zpravidla mnoţství, které se rozpustilo a absorbovalo před
uzavřením reaktoru) a anearobní (přístup kyslíku je zamezen).
Neméně důležité dělení je podle konstrukce bioreaktorů, pro ilustraci Obr. 3.2:
•
•
•
•
•
Míchání
▪ Mechanické, pneumatické nebo hydraulické
Fluidní vrstva
Náplňové
Speciální
Membránové, fotobioreaktory, reaktory pro kultivace na pevném substrátu, atd.
Kultivace SSC a SLC
Tyto podivné zkratky znamenají dva základní typy kultivací v klasifikaci podle
provedení, které mají zásadní vliv na typ pouţitého bioreaktoru. Jsou to kultivace na
pevném substrátu (SSC – solid-solid-cultivation) a submerzní kultivace v kapalině (SLC
– solid-liquid-cultivation). Toto pojmenování označuje pevnou fázi buňky versus pevnou
nebo kapalnou fázi substrátu.
Mezi rozdíly mezi SSC a SLC patří:
70
 Gradient ţivin
 U SSC přístup k povrchu buňky je omezen, ţiviny v bezprostředním okolí jsou
vyčerpávány a další musí k buňkám difundovat. SLC – v ideálně míchaném
reaktoru gradient neexistuje.
 Vrstva substrátu
 SSC - pro omezený transport ve vlhkém, ale pevném prostředí nemá smysl
pouţívat silnou vrstvu substrátu. Kapalného média bývá přebytek.
 Limitace transportu tepla a ţivin
 SSC - je dána omezenou difuzí, u SLC je přístup k buňkám dokonalý (pokud se
jedná o volné buňky) a je dána transportními procesy přes buněčné stěny a
membrány.
 Fáze
 SSC - třífázový systém pevná – kapalina – plyn, SLC – pouze dvoufázová systém
kapalina – plyn.
 Dodávka kyslíku
 SSC - kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze, coţ je problematičtější, SLC –
rozpuštěný kyslík z kapaliny a zároveň mezifázový přechod kyslíku z plynu do
kapaliny.
 Teplo
 SSC – teplo se odvádí plynou fází, SLC – kapalina je chlazena externím médiem
– nákladnější, ale mnohem účinnější.
 Sledování (monitoring) a řízení procesů
 SSC – velmi obtíţné aţ nemoţné, SLC – standardní postupy.
 Charakter růstu
 SSC – povrchový, SLC – submerzní.
 Koncentrace produktu
 Zde významná výhoda SSC – zpravidla vyšší koncentrace produktu ve srovnání
se SLC.
 Zvětšování měřítka procesu (scale-up)
 U SSC špatně definovatelné, u SLC standardní metodika.
Celkově spočívají výhody SSC pouze v jednoduchosti a nenáročnosti na strojní
vybavení, ve vyšší objemové koncentraci produktů a tím efektivnější izolaci, jednodušší
inokulaci a menším objemu odpadů. Dále v tom, ţe některé organismy se v submerzním
prostředí kultivují obtíţně, nebo netvoří ţádané produkty (např. Některé vláknité
mikroorganismy).
Ideální bioreaktor
Ideální bioreaktor má rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,
nízké provozní náklady. Zpravidla se jedná o submerzní bioreaktor, ale to závisí na
71
charakteru nositele procesu a procesu samém.
Bioreaktor je proto nutné vybírat, případně konstruovat, s přihlédnutím k těmto
parametrům procesu:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Přestup kyslíku
Přestup tepla
Přestup hmoty
Poţadavky na míchání
Nároky na energie
Citlivost kultury ke střiţným silám
Reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střiţné
síly)
Minimalizace odparu kapaliny
Tlaková odolnost
Sterilita operace
Čištění bioreaktoru
Bezpečnost
Účelová flexibilita a kompatibilita
Cena zařízení a jeho provozu
Přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up
Submerzní kultivace v kapalném médiu
Nadále se budeme věnovat submerzní kultivaci v kapalném médiu s volně
pohyblivou pevnou fází, jakoţto typickému příkladu bioreaktorových aplikací. Tyto
kultivace se vyznačují několika charakteristickými parametry. Míchání – zajišťuje
homogenitu vsádky, ideální přístup ţivin a odvod metabolitů, odvod tepla. Regulace
teploty, pH a v případě aerobních procesů průtoku vzduchu nebo obohaceného vzduchu
představují další základní parametry, které musí aerobní míchaný bioreaktor zajišťovat.
Poslední parametr, ne vţdy vyuţitý, je přítokovací systém.
Speciální bioreaktory
Mezi speciální bioreaktory řadíme například fotobioreaktory, zařízení různé
konstrukce umoţňující přístup světla k rostoucím fotosyntetizujícím kulturám, např.
Jednobuněčným řasám, cyanobakteriím.
Další velkou skupinou jsou bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi, o které bylo
stručně pojednáno výše. Konstrukce jsou opět různé, podle charakteru organismu a jeho
růstu. K těmto reaktorům se řadí i zařízení pro povrchový nárůst na kapalných médiích.
Bioreaktory pro kultivaci ţivočišných či rostlinných buněk – tkáňových kultur
72
přesahují rovněţ rozsah tohoto textu.
Míchání bioreaktorů
Nejčastějšími způsoby míchání bioreaktorů jsou pneumatické, s fluidním loţem a
zejména mechanické.
Pneumatické míchání bioreaktorů
Nejznámějšími zástupci jsou bublané kolony a air-lift reaktory. Charakterizovat je
lze takto:
 Probublávané reaktory (kolony)
 Cylindrická nádoba, poměr průměru k výšce 1:2 (kolona)
 Rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru
 Nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb
 Přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění vzduchu a rheologií kapaliny
 Maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 m/s
 Nevýhoda – obvykle malý přestup kyslíku
 Relativně malé mezifázové rozhraní
 Bubliny postupem vzhůru koaleskují (spojují se)
 Air-lift reaktory (s vestavbami)
 Vestavby – zaráţka, cirkulační trubka
 Funkce vestaveb:
 Dostatečná dispergace plynu – umoţňuje obnovování mezifázového povrchu
– zvyšuje přestup kyslíku
 Organizování toku fází
 Zvýšení doby prodlení plynu
 Zvýšení mikroturbulence
 Air-lift reaktory lze vybavit cirkulační trubkou nebo vnější cirkulací.
Princip bublané kolony a air-lift reaktoru s centrální cirkulační trubkou je patrný na
Obr. 3.3.
Obrázek 3.3. Pneumaticky míchané bioreaktory
73
a) bublaná kolona, b) air-lift reaktor s cirkulační trubkou.
Bioreaktory s fluidním ložem
V reaktorech s fluidním loţem proudí kapalina směrem vzhůru a nadnáší –
suspenduje částice pevné fáze. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované
mikroorganismy nebo enzymy. V horní rozšířené části se sniţuje rychlost proudění a tím i
suspendace – dochází k separaci částic od kapaliny, která můţe opustit reaktor. Tyto
reaktory mohou být i aerované, většinou probubláváním.
Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy.
Samotné buňky jsou příliš lehké, špatně sedimentují a jsou nevhodné pro cirkulaci ve
fluidním loţi. Uspořádání je kontinuální, ţiviny proudí přes náplň, metabolity a produkty
odváděny. Prostředí je nehomogenní, koncentrace ţivin se mění s výškou náplně, gradient
pH, špatné promíchávání. Tyto reaktory se vyuţívají např. Při inhibice produktem
(rozdílná koncentrace produktu podél náplně).
Mechanicky míchané bioreaktory
V mechanicky míchaných submerzních bioreaktorech se procesu opět účastní
třífázový systém, plyn-kapalina-pevná fáze, kde plynem je zpravidla vzduch, kapalinou
médium a pevnou fází nositelé procesu, buňky, flokuláty, aglutináty atd. Účelem míchání
je opět homogenizace, transport ţivin a tepla a v aerobních procesech dispergace bublin
aeračního plynu. Při míchání mechanickými míchadly vzniká střihové napětí, které
způsobuje rozbíjení bublin a tím zvětšuje mezifázovou plochu. Střihové napětí však
rovněţ působí negativně na pevnou fázi, zvláště na nepevné struktury, například vláknité
mikroorganismy.
74
Pro mechanicky míchané systémy je charakteristická vysoká turbulence a rychlý
přestup látky a tepla. U kyslíkově nenáročných, pomalých procesů a střihově citlivých
organismů se ale naopak pouţívají nízké rychlosti otáčení, větší plochy míchadel a jejich
speciální tvary omezující střiţné síly. Mechanické míchání je vţdy kompromis mezi
maximální dodávkou kyslíku a homogenizací a velikostí střihových sil.
Obrázek 3.4. Aerovaný míchaný bioreaktor
1 - nádoba bioreaktoru
2 - plášť
3,4 - izolace
5 – přívod inokula
6 – porty pro pH elektrody
7 - míchadlo
8 – aerační věnec
9 – ucpávka
10 - převodovka
11 – motor
12 – vypouštěcí otvor
13 – chlazení pláště
14 – vzorkovací otvor s připojením páry
15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)
16 – přívod roztoků na úpravu pH a
odpěňovadla
17 – vstup vzduchu
18 – víko
19 – přívod média
20 – odvod vzduchu
21 – porty pro senzory
22 – rozbíječ pěny
23 – přívod páry
24 – tryska
Základním systémem pro malé rigidní buňky s vysokou spotřebou kyslíku
(bakterie, kvasinky) je však mechanické míchadlo typu disková turbína, 4-6 listů, d
(průměr míchadla) asi 0.3 dT (průměr nádoby). Aby docházelo k co největší dispergaci,
je aerační věnec umístěn pod nejspodnějším míchadlem. Naopak, aby nedocházelo ke
vzniku středového víru a zvýšila se turbulence, je nádoba bioreaktoru vybavena
75
míchacími naráţkami, coţ jsou podélné obdélníkové vestavby, zpravidla umístěné
pravidelných vzdálenostech po vnitřním obvodu nádoby. Naráţky (zaráţky) pro
optimální promíchávání se umisťují v počtu 4-8, d (šířka naráţky) asi 0.1 dT.
Typická konstrukce aerovaného míchaného bioreaktoru (CSTR – continuous stirred tank
reactor) je na Obr. 3.4.
Základní typy míchadel
Základní typy míchadel jsou vrtulové, vyznačující se vysokou čerpací kapacitou,
menšími střiţnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense a turbínové, kde vysoké
střiţné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje
zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená. Na Obr. 3.5 a 3.6
jsou základní tvary míchadel.
Obrázek 3.5. Turbínová míchadla s různým tvarem a sklonem lopatek.
Obrázek 3.6: Míchadla
a) vrtulové, b) diskové turbínové s naráţkami, c) diskové turbínové bez naráţek.
76
CSTR standardního tvaru je vybaven obvykle více míchadly na společném hřídeli,
coţ výrazně zlepšuje homogenizace tanku, vzdálenost míchadel 1-1.5 D (průměr
nádoby), nejčastější počet je tři. Rychlost míchání je často omezena pouze konstrukčním
a materiálovým provedením bioreaktoru, avšak maximalizace otáček není efektivní ani
pro homogenizaci a provzdušnění.
Velikost míchadla se volí D/DT = 0.4-0.5 (průměr míchadla/průměr tanku), počet
naráţek je čtyři a jejich šíře 0.1 DT. Vzdušnění (aerace) podporuje míchání a sniţuje
míchací příkon. Poměr mezi příkonem aerovaného tanku (PG) a neaerovaného tanku (P)
vyjadřuje vztah:
VG je průtok aeračního plynu, n otáčky míchadla a d jeho průměr. Příkon
míchadel (P) je moţno počítat pro newtonské kapaliny podle vztahů:
kde P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, μ – dynamická
viskozita.
Přestup tepla
V aerobních míchaných bioreaktorech vzniká teplo exotermickou činností
mikroorganismů nebo exotermickými reakcemi, dále třením při míchání a aeraci.
Mnoţství uvolněného tepla u aerobních procesů je proporcionální spotřebovanému
kyslíku,
Q (kj/m3.s) = 0.12 . Ocr (mmol o2/m3.s)
kde Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol
utilizovaného O2. U submerzních kultur to bývá 3-15 kJ/m3.s.
Odvod tepla je realizován prostřednictvím aktivního chlazení přes externí plášť či
interní vestavby. Při zvětšování měřítka (scale-up) si přestup kyslíku a tepla zaslouţí
zvláštní pozornost - větší objem znamená menší chladicí plochu.
77
Aerace a přestup kyslíku
Aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace vyváří
relativně velké mezifázové rozhraní. Hodnotí se pomocí tzv. Stupně dispergace a:
kde Db – průměr bublin (ideálně 2-3 mm), ε – plynová zádrţ.
Celkový průtok vzduchu bioreaktorem se nejčastěji klasifikuje jako hodnota vvm
– volume/volume/minute:
Kde vg – průtok vzduchu (aeračního plynu), vr – objem reaktoru.
Přestup kyslíku je základní parametr, který charakterizuje aerobní bioreaktor. Je
obvykle vyjádřen koeficientem přestupu hmoty kla, který je konstantou úměrnosti mezi
rychlostí přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (OTR – oxygen transfer rate) a
gradientem koncentrací:
kde C*,C – rovnováţná a aktuální koncentrace kyslíku. Rychlost spotřeby kyslíku
mikroorganismy nebo biotransformační reakcí je charakterizována vztahem:
kde X – koncentrace biomasy, qo2 – specifická respirační rychlost, μ – specifická růstová
rychlost, Yx/o – výtěţnost biomasy na kyslík.
Rovnováţnou koncentraci kyslíku ovlivňují především fyzikální vlastnosti média
- teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita). Aktuální koncentraci pak
geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zaráţky,
aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace, vlastnosti kapaliny
(morfologie a koncentrace mikroorganismů, odpěňovací činidla). Ve velkých
fermentorech (>5000 L) bývá OTR < 300 mmol/L.h.
Zvyšování přestupu kyslíku (OTR) se provádí zvýšením průtoku vzduchu,
zvýšením otáček míchadla, zvýšením tlaku v bioreaktoru, zvýšením obsahu kyslíku ve
vzduchu. Je však třeba upozornit, ţe vzájemné závislosti jsou nelineární a jsou
popisovány poměrně sloţitými modely.
78
Kultivační půdy – média
Kultivační média jsou nezbytná pro kultivaci - růst a metabolismus
mikroorganismů. Dále tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje fyziologii a chování
mikroorganismů a tím ovlivňují výtěţnost, rychlost tvorby produktu a sloţení produktu.
Ţiviny obsaţené v médiu jsou potřebné pro růst buněk, získávání energie pro syntézu
produktů a zachování buněčné integrity.
Pro technologické účely dělíme média na KOMPLEXNÍ a DEFINOVANÁ.
Komplexní média obsahují zpravidla všechny potřebné ţiviny v ne zcela přesně
definovaném sloţení, coţ je dáno jejich původem. Bývá to organický zdroj ţivin, např.
Hydrolyzáty proteinů (peptony), extrakty masa, kvasnic, mléka, různé směsi rostlinných
ţivin apod. Definovaná média mají přesně známé sloţení, obvykle roztoky minerálních
solí, čisté esenciální ţivných komponent a jeden nebo více zdrojů uhlíku a energie.
Médium představuje zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu
nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy, dále zdroj
energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouţí k výrobě
energie (jako donory nebo akceptory elektronů). Elementární sloţení všech mikrobiálních
buněk je relativně podobné – moţnost odhadu obecných poţadavků mikroorganismů na
ţiviny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P).
Při návrhu sloţení média je nutno znát biochemii kultivace, jeho případný vliv na
metabolismus a fyziologii buněčné populace, dále účel kultivace a průběh DSP. Cena
média tvoří přes 50% ceny konečného produktu, je tedy třeba ji zohlednit. Důleţitá je
také stálost jeho sloţení.
Formulace média je vţdy kompromis mezi nutričními poţadavky, cenou a
dostupností sloţek. Elementární chemické sloţení média se určí ze sloţení biomasy a
produktu, výtěţnostních koeficientů a doplňkových experimentů.
Uhlíkatý substrát - část je oxidována na CO2 (disimilace), vyuţití takto získané
energie je na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace). Poměr asimilované a
disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje. Maximální výtěţnost substrátu čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí
se to v YX/S.
Hlavní elementární sloţky médií jsou obvyklé biogenní prvky. Dalšími sloţkami
jsou stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu, růstové faktory - esenciální org. sloučeniny,
které si buňka neumí sama syntetizovat, vitamíny – často kofaktory enzymů, Laminokyseliny – především glutamová, puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových
kyselin, VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná, odpěňovadla – povrchové napětí,
oleje, polyglykoly polymery (PPG).
Při přípravě médií je nutno dbát na pH a iontovou rovnováhu. Ke stabilizaci pH se
79
uţívají pufry (organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES). Regulace pH se
provádí během kultivací, většinou pomocí NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4. Iontová síla i
redox potenciál také ovlivňují růst, produkci a produkty.
Příprava inokula
Průmyslové kultivační procesy začínají stejně jako laboratorní, z čisté kultury
produkčního kmene. Kmeny se uchovávají standardním způsobem, lyofilizované,
hluboko zmrazené, nebo klasicky přeočkováváním na pevných, mnohdy selektivních
půdách. Revitalizace se obvykle provádí v kapalném médiu.
Abychom dosáhli potřebného kultivačního objemu, je zpravidla zapotřebí
několika stupňů. Všem stupňům před produkčním se říká inokulační, objemový poměr
pro převod je 1:10 aţ 1:20, můţe však být i mnohem vyšší; pak je třeba počítat s delší lag
fází.
V inokulačních stupních je důraz na růst, nikoli produkci, často se pouţívají
komplexní média. Stupňů by mělo být co nejméně, mohou způsobit změnu chování nebo
charakteru kultury.
Sterilizace u bioreaktorů
Řada produkčních procesů je aseptických. Sterilita znamená nepřítomnost ţivých
organismů, tedy vyjma těch produkčních. Kultivačnímu procesu tedy předchází
odstranění veškerých ţivých mikroorganismů ze zařízení a je nutné zabránit vstupu
kontaminace po sterilaci. Provádí se tedy sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího
zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací
zařízení, senzory atd.).
Kontaminace způsobuje například:
•
Produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene)
•
Produkci enzymů (degradace produktu)
•
Sníţení výtěţnosti (spotřeba substrátu)
•
Produkci metabolitů (polysacharidy)
•
Spotřebu části substrátu (výtěţnost).
Vlastní sterilizace média a bioreaktoru se provádí:
80
• ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa
• horkým vzduchem 150-180ºC
• chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd....
• UV, X-rays – většinou povrchy, prostory
• ultrafiltrace – plyny, roztoky
• velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu
Hodnocení sterility
Pouţívá se tzv. D-hodnota – sníţení počtu zárodků na 1/10, která závisí na
odolnosti mikroorganismu.
kde n – počet ţivých zárodků, t – čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché
teplo.
Sterilizace vzduchu a odplynů
 Nutnost sterilizace velkých objemů:
 Vzdušnění obvykle 1 VVM
 10 m3 reaktor – za 48 h 29 000 m3 vzduchu
 Koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu
 Ultrafiltrace – splňuje všechny poţadavky, pouţívá se ke sterilizaci vzduchu,
hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 μm
Inokulace
Inokulace je aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně. Je
vhodné ji provádět pomocí sterilizovatelného potrubního spojení tanků a čerpat tlakem
sterilního vzduchu. Také se pouţívají sterilní inokulační jehly a septa v aperturách ve
víku bioreaktoru. V tom případě se pouţívají sterilní hadice a čerpání peristaltickými
čerpadly - inokulum tak nepřichází do styku s čerpadlem.
81
Základní typy kultivačních procesů
 Vsádková (batch)
 Uzavřený systém, není průběţný přítok ţivin ani odvod metabolitů
 Přítokovaná (fed-batch)
 Přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantní
 Kontinuální (continuous cultivation)
 Otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru

Vsádková kultivace (batch)
Jedná se o uzavřený systém, všechny ţiviny i inokulum jsou přivedeny na počátku
kultivace a postupně spotřebovávány, dochází k akumulaci biomasy a metabolitů. Objem
bioreaktoru je konstantní, zanedbává se změna objemu při úpravě pH, odpěňování,
vzdušnění.
Fáze vsádkové kultivace:
•
Lag fáze
•
Exponenciální fáze
•
Stacionární fáze
•
Fáze odumírání
•
Mezi jednotlivými fázemi jsou tranzientní stavy
Snaţíme se obvykle o minimalizaci lag fáze, prodlouţení a exponenciální fáze.
Při produkci ve stacionární fázi se prodluţuje tato.
V exponenciální fázi probíhá intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako
koncentraci buněk nebo biomasy.
kde x je koncentrace biomasy, μ růstová rychlost, t čas, x0 počáteční koncentrace
biomasy.
Chceme-li proces urychlit (produkt je přímo spojen s růstem), maximalizujeme
růstovou rychlost:
•
Sloţení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.
•
Mnoţství vytvořené biomasy přímo úměrné mnoţství spotřebované ţiviny
•
výtěţnost (yield):
82
•
Rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby ţiviny a naopak
•
Hodnota yx/s je za různých podmínek různá.
Typický průběh vsádkového procesu v exponenciální fázi ukazuje Obr. 3.7.
Obrázek 3.7. Vsádkový proces
s - substrát, O - rozpuštěný kyslík, P - produkt, X – biomasa, μ – růstová rychlost.
Řízením vsádkového procesu se pokoušíme:
•
Produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu
•
Produkce primárního metabolitu – prodlouţení exponenciální fáze růstu za současné
produkce metabolitu
•
Produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodlouţená
stacionární fáze.
83
Přítokovaná kultivace (fed-batch)
Jedna nebo více ţivin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt
zůstává v bioreaktoru, Vr není konstantní. Řízením rychlosti přítokování limitujícího
substrátu lze ovlivnit rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a
metabolismu. Výhodou je, ţe řízenou změnou koncentrace ţivin lze ovlivnit výtěţek
nebo produktivitu. Ţiviny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem
bioreaktoru roste.
Fed-batch kultivace se pouţívá kdyţ nastává nebo je třeba:
•
Substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)
•
Hustá kultura – vysoká koncentrace buněk
•
Glukosový efekt (over-flow metabolismus)
•
Katabolická represe – snadno metabolizovatelný zdroj (glukosa)
•
Optimalizace tvorby metabolitu – produkce ak, řízené udrţování nízké koncentrace s
•
Prodlouţení produkční fáze (oddělení produkční a růstové fáze) – sekundární
metabolity
Strategie řízení přítokování
Strategie řízení přítoků při fed-batch kultivacích jsou různé, např. Koncentrace
substrátu se udrţuje konstantní nebo se mění podle předem připraveného, či adaptivního
algoritmu. Pomalý konstantní přítok média vede zpravidla k lineárnímu růstu celkové
biomasy, exponenciální přítok média (a v něm limitujícího substrátu) by měl způsobit
exponenciální růst. Moţné je i přítokování média podle zvoleného parametru spojeného s
růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace).
Přítokování podle předem daného schématu lze realizovat jako přerušovaný
nástřik nebo kontinuálně dle vypočtené funkce. Pokud má přítokování reagovat na stav
kultivace pak se vyuţívá zpětná vazba je přímá, podle měření koncentrace substrátu v
bioreaktoru, podle toho upraven nástřik nebo nepřímá – měření jiných parametrů, které
jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.
Kontinuální kultivace
Kontinuální kultivace je otevřený systém,
(nepřetrţitému) dodávání ţivin (média) a zároveň
pozměněného metabolickou činností mikroorganismů i s
je rovna rychlosti odtoku, objem bioreaktoru je
84
kde dochází k plynulému
k plynulému odběru média
částí biomasy. Rychlost přítoku
konstantní. K rozmnoţování
mikroorganismů dochází za podmínek blíţících se optimu.
Základním a nejméně náročným typem kontinuální kultivace je chemostat:
V chemostatu je konstantní rychlost přítoku média f a konstantní zřeďovací
rychlost d, rychlost přítoku substrátu je tedy rovna rychlosti spotřeby substrátu a
mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní μ a konstantní X.
Dalšími typy kontinuálních kultivací jsou např. Turbidistat, kde je konstantní
turbidita (koncentrace biomasy) a mění se D (automatická regulace), nebo auxostat, kde
je konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat:
DOT=konst, CO2stat: CO2=konst).
Optimalizace bioprocesu
Hlavní faktory, které určují kvalitativní i kvantitativní výsledky bioprocesů jsou:
•
Konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene
•
Optimalizace sloţení média
•
Výběr typu kultivace
•
Podle optimalizovaného parametru, technických moţností a dalších kritérií
•
Optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
Optimalizace složení média
Prvním krokem je určení kvalitativního a semikvantitativního sloţení média. Za
tím účelem se provádějí baňkové pokusy a ke sníţení počtu experimentů se vyuţívají
optimalizační metody, např. Experimentální design odvozený od response surface
methodology, optimal či central composition design. Velmi důleţitá je ekonomika sloţení
média, zvláště v produkčních stupních.
Dalším krokem je určení kvantitativního sloţení média, kde se vychází z
experimentů v laboratorním fermentoru a vhodného strukturovaného modelu s bilancí
procesu. Matematický model procesu nebo zařízení zahrnuje vztahy popisující jeho
chování v čase, je tvořen diferenciálními a nelineárními rovnicemi. Základem bývá
bilance:
VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE
85
Model procesu či zařízení je pro reálné pouţití třeba identifikovat, určit hodnotu
konstant a parametrů. Pouţívají se metody shody experimentu s předpovědí modelu,
např. Aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců. Optimalizačními kritérii
jsou pak extrémy funkcí, kritérium optimalizace nazýváme účelovou funkcí.
Optimalizované proměnné jsou obvykle μ, π, YP/X, YP/S.
Optimalizace kultivačních parametrů
Základními kultivačními parametry jsou:
 Teplota
 Optimální růstová teplota kmene, lze vyuţít pro změny rychlosti růstu a produkce
 pH
 Optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv sloţení média,
indikátor metabolismu
 Aerace (řízení DOT)
 Podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v různých fázích, řízení
dostupnosti energie, změny metabolismu
Monitoring a automatizace
Prvky zajišťující monitoring a automatizační hardware a software jsou v dnešní
době jiţ konstrukčními součástmi bioreaktorů. Reaktory jsou vybaveny senzory a
zařízeními pro měření základních stavových veličin, jako jsou pH, teplota, do, redox,
dco2, odplyny, x, s, p a pro měření a řízení základních procesních parametrů, jako jsou
otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky. Ještě v nedávné době to bylo realizováno
prostřednictvím analogových měřících a řídících jednotek, dnes je standardem ddc (direct
digital control) realizované plc (procesními počítači. S nimi spolupracují nadřazené
monitorovací, archivační a řídící systémy.
Základní regulace chodu bioreaktoru se dotýká:
 pH – automatizované dávkování H+ a OH Teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média
 DO (koncentrace rozpuštěného kyslíku –
 Otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měniče
 Průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS
86
(hmotová spektrometrie) měření
 Tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP (set-point, ţádaná
hodnota)
 Přítokování  Tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji váţením reaktoru nebo
zásobníku.
Kultivace rekombinantních mikroorganismů
Prokaryotní expresní systém – E. coli
Dosud nejvíce vyuţívaný prokaryotní expresní systém, zejména pro enzymy a
proteiny je prokaryotní expresní systém – E. coli. Produkce proteinů probíhá v
cytoplasmě a periplasmatický prostor, k dispozici je mnoho expresních vektorů a
promotorů. Nevýhodami jsou nestabilita vektorů, poruchy v iniciaci translace a elongace,
nestabilita mRNA a toxicita produktů pro hostitelskou buňku.
Kultivace rekombinantní E. coli má ale řadu výhod, lze kultivovat do vysoké
hustoty (HCDC) – (fed-batch), lze vyuţít konstitutivní i regulované exprese (regulace
promotoru negativně represí nebo pozitivně – indukcí). Obvyklou kultivační strategií je v
první fázi nárůst biomasy, v další indukce exprese. Rizikem je moţná špatná konformace
proteinů (folding), agregace za vzniku inkluzních částic. Obvykle se to řeší sníţením
kultivační teploty – redukce rychlosti syntézy proteinů, správné sbalení.
Doba kultivace je závislá na kmeni a médiu, indukuje se často ve vrcholící
exponenciální fázi, vetšinou se tak získá maximum biomasy. Jako strategie se uţívá batch
i fed-batch.
Doba exprese je závislá na kmeni a médiu, v produkční fázi dochází ke zpomalení
růstu – vliv niţší teploty a a probíhající exprese. Bývá nutné experimetální stanovení
optimálního lineárního přítokování. Samovolné zvýšení růstové rychlosti často znamená
ztrátu plasmidu. Kultivaci je třeba ukončit před přechodem k degradaci produktu.
Obvyklá doba 12 – 40 hodin.
Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris
Eukaryotní expresní systém je mladší generace, velmi populární, pracuje v
methylotrofní kvasince
pichia pastoris. Disponuje silným promoterem pro
alkoholoxidasu AOX, výhodou je snadná indukce a regulace. Kvasinka má silně
respirativní růst, kultivace se daří v hustých kulturách. Pouţívá se pro expresi velkých
proteinů (>50 kD). Výhodou je rovněţ posttranslační modifikace – glykozylace,
odstranění signálních peptidů, tvorba disulfidových můstků.
87
Kultivace rekombinantní P. pastoris je třístupňový proces, proto je zde nutnost
optimalizace vyšší neţ jinde. První fází je batch na glycerolu, kdy se vyprodukuje
biomasa za současné represe genové exprese. Následuje adaptační fáze – první fed-batch,
kdy je glycerol přítokován rychlostí limitující růst a poslední je produkční fáze – druhý
fed-batch, kdy je methanol (směs methanol+glycerol) přítokován v závislosti na
fenotypu, dochází k indukce exprese.
Použité zdroje
 Kultivační techniky, sylabus ÚKCHB VŠCHT
 http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
 Bioinţenýrství kvasných procesů (Mojmír Rychtera a Jan Páca, VŠCHT Praha 1987)
 Fyziologie bakterií (František Kaprálek, SPN 1986)
 Bioinţenýrství (František Kaštánek, Academia 2001)
88
4. SEPARACE BIOMASY A HRUBÁ IZOLACE CÍLOVÝCH
MOLEKUL
Separace biomasy od kultivačního média
Ssedimentace
Filtrace
Tangenciální filtrace
Průtoková centrifugace
Spůsoby dezintegrace biomasy a izolace produktu z ní
Fyzikální metody dezintegrace
Chemické metody dezintegrace
89
5. METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ
Selektivní precipitace
Rozpustnost biomakromolekul ve vodném roztoku je ovlivněna jejich solvatací
molekulami vody, která můţe být ovlivněna změnou hodnoty pH, teploty, iontové síly,
přídavkem solí či organických látek rozpustných ve vodě. Kombinací různých sráţecích
činidel tak byly vytvořeny postupy pro sráţení, precipitaci různých skupin
makromolekul. Pro úspěšnost precipitace je důleţité zvolit nejen vhodné činidlo, ale i
vhodnou výslednou koncentraci činidla v precipitovaném vzorku. Změnou koncentrace
precipitačního činidla v roztoku se totiţ změní specifičnost procesu precipitace.
Globulární proteiny, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, jsou ve své
nativní formě uspořádány tak, ţe rezidua polárních aminokyselin jsou orientována vně
molekuly proteinu, zatímco nepolární vedlejší řetězce směřují do nitra molekuly, a tak
nejsou ve styku s vysoce polárním vodným prostředím. Stabilita nativní konformace je
dána jednak hydrofobními interakcemi uvnitř molekuly, jednak inter- i
intramolekulárními vodíkovými vazbami vně molekuly. Dojde-li k narušení rovnováhy
mezi jednotlivými interakcemi, je molekula proteinu denaturována a dochází k precipitaci
tohoto proteinu. Tato precipitace můţe být jak vratná – reverzibilní, tak nevratná –
ireverzibilní.
Jedna z reverzibilních metod precipitace proteinů je zaloţena na skutečnosti, ţe
nejniţší rozpustnost vykazuje protein ve svém izoelektrickém bodu. Voda je vysoce
polární rozpouštědlo, a tudíţ se v ní velmi dobře rozpouští látky s elektrickým nábojem.
V izoelektrickém bodu jsou kladné i záporné náboje vyrovnány, takţe molekula jako
celek je bez náboje, coţ sniţuje její rozpustnost ve vodě. Opětovnou změnou pH lze
protein opět denaturovat a převést tak zpět do roztoku.
Patrně nejpouţívanější metoda sráţení proteinů vyuţívá síranu amonného. Velkou
výhodou (NH4)2SO4 je moţnost jej připravit v dostatečně velkých koncentracích pro
sráţení takřka všech proteinů, takřka nepatrná produkce tepla při přídavku jeho roztoku,
niţší hustota jeho roztoku umoţňující odstranění precipitátu centrifugací a v neposlední
řadě i skutečnost, ţe jeho koncentrovaný roztok je bakteriostatický. Vzhledem ke
skutečnosti, ţe je nutné jej pouţít pro sráţení proteinů, které nejsou příliš zředěné,
zařazuje se precipitace pomocí (NH4)2SO4 obvykle mezi počáteční kroky při izolaci
proteinů. Precipitát lze od roztoku oddělit centrifugací, následně rozpustit ve vhodném
pufru a poté oddělit (nh4)2so4 gelovou filtrací či ultrafiltrací. Specifičtější precipitace lze
dosáhnou postupným zvyšováním koncentrace (NH4)2SO4, rozdílné proteiny jsou totiţ
precipitovány při rozdílných koncentracích (NH4)2SO4.
90
Tepelná denaturace naproti tomu představuje ireverzibilní metodu precipitace.
Tímto způsobem lze vysráţet poměrně širokou skupinu neţádoucích proteinů, které se
následně oddělí centrifugací. Obvykle spočívá zmíněná metoda v zahřívání míchaného
roztoku proteinu na vodní lázni na teplotu 90°C.
Nukleové kyseliny jsou vůči ireverzibilní precipitaci odolnější neţ proteiny.
Stejně jako proteiny jsou i nukleové kyseliny polární makromolekuly, které tak lze
vysráţet změnou pH či přídavkem méně polárních organických rozpouštědel.
Nejpouţívanější precipitační metodou pouţívanou pro sráţení nukleových kyselin
je precipitace alkoholem. Pouţívá se zejména etanol či isopropanol v přítomnosti 0,1 aţ
0,5 m octanu sodného či draselného o hodnotě pH 5,0. Následkem konformačních změn
nukleových kyselin dochází k jejich precipitaci. Při vyšších koncentracích probíhá
precipitace kvantitativně i při 25 °c, zatímco při niţších koncentracích nukleových
kyselin je pro jejich kvantitativní precipitaci nutná inkubace v mrazu.
Pro velmi zředěné roztoky nukleových kyselin lze pouţít precipitaci pomocí 10%
polyethylenglykolu 6000. Jedná se o časově náročnější metodu, která však podobně jako
sráţení proteinů síranem amonným umoţňuje frakční precipitaci. Nukleové kyseliny
vyšších molekulových hmotností se totiţ sráţí jiţ při niţších koncentracích
polyethylenglykolu, zatímco nukleové kyseliny s niţší molekulovou hmotností se stále
nachází v roztoku.
Chromatografické metody
Velmi účinnou separační metodou, která našla široké uplatnění jak při izolaci
látek ze směsí, tak při stanovení rozličných látek v široké škále vzorků, je
chromatografie. Ta je zaloţena na rozdělení látky mezi dvě nemísitelná prostředí,
stacionární fázi ukotvenou na pevném nosiči-matrici a mobilní fázi protékající kolem
stacionární fáze. Bylo vyvinuto mnoho chromatografických metod, které se od sebe
mnohdy výrazně liší. Mohou být vhodné pro separaci látek nízkomolekulárních i
makromolekul. Separaci lze provádět podle rozdílné molekulové hmotnosti, polarity,
izoelektrického bodu či dle přítomnosti funkční skupiny či značky, která specificky
interaguje se stacionární fází.
Podle prostorového uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na plošnou
a sloupcovou. Plošná chromatografie má stacionární fázi uspořádanou v ploše, jedná se
buď o tenkovrstvou chromatografii (TLC), u níţ je stacionární fáze umístěna na tenké
vrstvě, např. Na hliníkové folii, nebo o papírovou chromatografii (PC), kde je stacionární
fáze voda adsorbovaná v pórech papíru. Plošná chromatografie je nenáročná na
laboratorní provedení, papírovou chromatografii lze provést i s obyčejným savým
papírem, ovšem v současné době ztrácí na svém významu. Slouţí zejména pro relativně
rychlou detekci kontaminantů či drog, např. V moči, a některých reakčních produktů
v organické chemii.
91
U sloupcové chromatografie tvoří stacionární fáze náplň kolony nebo tenké
kapiláry. Mobilní fáze protéká kolonou nebo kapilárou a unáší s sebou vzorek aţ na
konec kolony. Za kolonou či kapilárou se stacionární fází se nachází detektor, který
zaznamená průchod vzorku. Svým významem sloupcová chromatografie výrazně
převyšuje chromatografii plošnou.
Mobilní fází můţe být u sloupcové chromatografie plyn, pak hovoříme o plynové
chromatografii (GC), nebo kapalina v případě kapalinové chromatografie (LC). V případě
plošné chromatografie je mobilní fází kapalina. GC má velký význam zejména v
analytické chemii pro separaci plynných a těkavých nízkomolekulárních látek. Příkladem
jejího vyuţití je stanovení obsahu alkoholu v krvi. Pro GC se jako nosiče stacionární fáze
vyuţívají tenké kapiláry, jejichţ délka dosahuje i několika desítek metrů.
Naproti tomu LC lze pouţít pro separaci vysokomolekulárních i
nízkomolekulárních látek. Stacionární fáze můţe být rovněţ v tenké kapiláře, ale i
v koloně, jejíţ vnitřní průměr můţe dosáhnout i několika cm. Kapalina tvořící mobilní
fázi se můţe pohybovat kolonou buď vlivem gravitace, nebo pomocí pumpy. Pouţitím
pumpy se zvyšuje zpětný tlak stacionární fáze a rychlost průtoku mobilní fáze. Sloţení
mobilní fáze můţe být při celé separaci konstantní, nebo se můţe v průběhu separace
měnit. V závislosti na tom hovoříme o isokratické, krokové (jednorázová změna) či
gradientové (postupná změna mobilní fáze) eluci. Po ukončení eluce je třeba promýt
kolonu původní mobilní fází, aby byla připravena pro další pouţití. Kapalinovou
chromatografii je moţné rozdělit na mnoho rozmanitých metod.
Tabulka 5.1. Nejběžnější typy kapalinové chromatografie
Typ LC
Princip
Adsorpční chromatografie
Adsorpce na povrchu pevné stacionární fáze
Afinitní chromatografie
Selektivní interakce analytu se stacionární fází (např. antigen –
protilátka)
Gelová chromatografie
Zadrţování malých molekul jejich vstupem do pórů gelu
Hydrofobní interakce makromolekul se stacionární fází ve vodném
prostředí
Iontově
výměnná Interakce iontů s opačně nabitými skupinami stacionární fáze (zvlášť
chromatografie
pro anionty a kationty)
Záchyt nepolárních látek nepolárními řetězci stacionární fáze v
Reverzní chromatografie
polárním organickém prostředí
Hydrofobní chromatografie
Důleţitou součástí sloupcové chromatografie je detektor. Ten se umisťuje za
kolonu a umoţňuje detekovat a stanovit látky opouštějící kolonu a určit čas potřebný
k jejich průchodu kolonou – eluční čas. V chromatografii se pouţívá mnoho typů
92
detektorů. Nejčastěji se pouţívá spektrofotometr, hmotnostní spektrometr, voltmetr,
ampérmetr, vodivostní detektor, fluorescenční detektor a další. Volba správného
detektoru je takřka stejně důleţitá jako volba správné chromatografické metody.
K detektoru bývá připojeno záznamové zařízení, obvykle počítač nebo posuvný
zapisovač, které ukládá naměřená data. Jejich grafickým vyjádřením je chromatogram
zobrazující závislost signálu detektoru na čase.
Afinitní purifikace
Afinitní chromatografie je nejefektivnější chromatografická metoda, přestoţe není
moţné ji aplikovat na všechny problémy. V praxi se při purifikacích obvykle jedná o
poslední (ne-li jediný) purifikační krok. Vyuţívá biochemicky specifickou interakci mezi
dvěma druhy látek. Jedná se např. O dvojici antigen–protilátka, enzym–substrát, enzym–
koenzym či protein–specifický ligand. Lze vyuţít i tak vysoce specifickou interakci, jako
je interakce komplementárních řetězců nukleových kyselin.
Základním předpokladem afinitní chromatografie je schopnost matrice kovalentně
navázat ligandy, které se specificky váţí na purifikovanou látku. Při purifikaci
polymerních produktů z geneticky modifikovaných organismů se často vyuţívá
specifická značka určená pouze pro usnadnění purifikace. Příkladem jsou proteiny
obsahující na c-konci řetězce šestkrát his, které jsou specificky zachyceny kyselinou
nitrilotrioctovou koordinačně spojenou s Ni2+ nebo Co2+. Mnoho postupů je natolik
specifických, ţe lze z buněčného extraktu získat v jediném kroku pomocí afinitní
chromatografie poţadovanou látku. Některé ligandy a jimi zachycované molekuly jsou
uvedeny v Tab. 5.2.
Při afinitní chromatografii se vyuţívají dvě mobilní fáze. Jedná se o ekvilibrační
a eluční pufr. Ekvilibračním pufrem je kolona promývána před nanesením vzorku, který
by měl být rozpuštěn ve stejném či podobném pufru. Po nanesení vzorku je dále na
kolonu čerpán ekvilibrační pufr do doby, neţ dojde k eluci nezachycených látek. Po eluci
nezachycených látek dojde k zapojení elučního pufru, slouţí k vymytí látek specificky
zachycených na koloně. Jeho eluční síla je oproti ekvilibračnímu pufru výrazně vyšší
díky obsahu stejného ligandu, který zachycuje purifikovanu látku či jeho analogu. Tento
volný ligand kompetuje (soutěţí) s ligandem vázaným k matrici o vazbu do vazebného
místa zachycené molekuly, a tak ji uvolňuje z vazby s ukotveným ligandem. Jinou
moţností zvýšení eluční síly bývá změna pH, pouţití chaotropních solí či organických
látek narušujících vazbu ligandu s purifikovanou molekulou. Např. Proteiny
s histidinovou značkou lze z kolony s obsahem Ni2+ či Co2+ vymýt pomocí pufru
s imidazolem. Změna pH či pouţití chaotropních solí můţe vézt k poškození
purifikovaných komponent. Existují i protokoly, v nichţ se nepouţívá kroková, ale
gradientová eluce.
93
Je-li purifikovaná látka vázána na kotvený ligand příliš pevně, bývá prospěšné po
aplikaci elučního činidla na kolonu zastavit jeho tok a nechat je chvíli působit. Obvykle
se tok zastavuje na 10 minut aţ 2 hodiny.
Afinitní chromatografii lze rovněţ pouţít pro selektivní odstranění vybraných
kontaminantů. V tomto případě se vybírá stacionární fáze tak, aby zachytila tuto
nečistotu, která je po získání frakce se vzorkem vymyta elučním pufrem dle výše
zmíněného principu.
Tabulka 5.2. Některé ligandy používané při afinitní chromatografii
Ligand
Zachycované molekuly
Arginin
Prothrombin, plasminogen
Kyselina nitriloctová v komplexu Co2+
Proteiny s histidinovou značkou
či Ni2+
Polymyxin
Endotoxin
Heparin
Proteiny vázající nukleové kyseliny
Protein A, protein G
Imunoglobin G
5’-AMP
ATP dependentní kinasy, NADP+ dependentní enzymy
Nukleové kyseliny
Komplementární řetězce nukleových kyselin, histony
Lektin
Polysacharidy, glykoproteiny
2’,5’-ADP
NADP+ dependentní enzymy
Iontově výměnná chromatografie
Iontově výměnná chromatografie, nazývaná často téţ iontoměničovou
chromatografií, je zaloţena na interakci iontů vzorku a mobilní fáze s opačně nabitými
skupinami ve stacionární fázi. Podle náboje zadrţovaných iontů dělíme iontoměniče na
anexy a katexy. Anexy zachycují anionty a jejich stacionární fáze tudíţ obsahuje kladně
nabité skupiny, zatímco katexy zachycují kationty.
Díky skutečnosti, ţe mnoho biomakromolekul nese v nativním stavu náboj, jehoţ
hodnota i znaménko se při změně pH postupně mění, je iontoměničová chromatografie
významnou purifikační metodou pro separaci proteinů, polysacharidů a dalších
biopolymerů. Tyto polymery totiţ obsahují mnoho protonizovatelných skupin, přičemţ
jejich míra protonizace je závislá na hodnotě pH.
Jako nosiče stacionární fáze se vyuţívá mnoho rozličných polymerů. Z přírodních
polymerů se jedná o celulosu, dextran či agarosu, mezi syntetické nosiče patří polystyren,
polyakrylamid a mnoho dalších. Tyto nosiče jsou derivatizovány nabitými skupinami.
Slabé anexy obsahují obvykle primární či sekundární aminoskupinu, silné anexy
kvartérní aminoskupinu. Záporný náboj slabých katexů je tvořen karboxylovými
94
skupinami, zatímco u silných katexů se vyuţívá síranová skupina. Slabé katexy potřebují
mobilní fázi s pH kolem 4, zatímco slabé anexy s pH kolem 11. Přiblíţí-li se pH
k neutrální hodnotě, ztrácí tyto katexy i anexy svůj náboj. Naproti tomu silné katexy
i anexy je moţné pouţít při širším rozsahu pH. Dostupné jsou ionexy s pracovním
rozsahem jedné jednotky i deseti jednotek pH.
Před nanesením vzorku je nutno promýt kolonu mobilní fází, která bude pouţita
pro nanášení vzorku a promývání kolony. Hodnota pH mobilní fáze vytékající z kolony
musí odpovídat hodnotě mobilní fáze vstupující do kolony. V opačném případě nelze
nanést vzorek na kolonu.
Eluční síla mobilní fáze závisí na jejím pH a na její iontové síle. V případě změny
pH je změna iontové síly způsobena změnou v ionizaci separovaných látek. Slabé
kyseliny se v bazickém prostředí vyskytují ve formě aniontu a v kyselém ve formě
neutrálních molekul. Podobně je tomu u slabých bází. Při zvýšení iontové síly mobilní
fáze se k nabitým skupinám stacionární fáze dostává větší mnoţství iontů, které vzájemně
soutěţí (kompetují) o moţnost iontové vazby s touto skupinou.
Mobilní fáze je u iontově výměnné chromatografie buď gradientová, či se
skokovým zvýšením eluční síly, jak je tomu u afinitní chromatografie. Gradientová
mobilní fáze s postupně rostoucí či klesající hodnotou pH je vyuţívána při dělení látek
dle izoelektrického bodu. Sbíráním frakcí mobilní fáze tak můţeme získat separované
látky vzorku tak, jak postupně s měnícím se pH ztrácí svůj náboj díky vyrovnání počtu
kladně a záporně nabitých skupin.
Při volbě podmínek iontově výměnné chromatografie je nutné uváţit mnoho
faktorů, které úţí moţný výběr experimentu. Jedná se o náboj separovaných molekul a
jeho velikost. Molekula s jedním záporným nábojem je eluována při niţší koncentraci
chloridů v mobilní fázi neţ molekula se dvěma či třemi náboji. Dále je nutno vzít v úvahu
izoelektrický bod – hodnotu pH, při které je celkový náboj molekuly, obsahující kladně
i záporně nabité skupiny, nulový. Kladně nabitá molekula s vyšší hodnotou
isoelektrického bodu je tudíţ eluována při vyšší hodnotě pH.
Gelová filtrace
Gelová filtrace umoţňuje separovat od sebe látky na základě jejich rozdílné
molekulové hmotnosti a je zaloţena na existenci přesně definovaných či různě velkých
pórů v částicích gelu. Malé molekuly při průchodu kolem částic gelu vstupují difuzí do
zmíněných pórů a jsou tak zadrţovány, zatímco velké molekuly se do těchto pórů
nedostanou a jsou vylučovány z kolony. Proto se pro gelovou filtraci pouţívá i označení
gelová permeační (zadrţovací) či exlusní (vylučovací) chromatografie.
95
Gelová filtrace je pouţitelná zejména pro oddělení nízkomolekulárních látek od
látek vysokomolekulárních, např. Pro odsolení roztoků proteinů, separaci makromolekul
podle jejich molekulové hmotnosti a určení molekulové hmotnosti makromolekul.
V poslední zmiňované funkci ji však stále častěji nahrazuje hmotnostní spektrometrie.
Stacionární fází u gelové filtrace je kapalina uvnitř pórů gelu. Ideální nosič
stacionární fáze, který vytváří gelové částice, by měl být hydrofilní polymer bez náboje,
maximálně inertní a pevný. V praxi se pouţívají především přírodní polymery na bázi
agarosy či dextranu. Komerčně dostupné jsou gely s různým stupněm zesíťování
polymeru, které zvyšuje jeho pevnost a rovněţ určuje velikost pórů gelu. Velikost těchto
pórů určuje rozsah velikosti částic, které lze daným gelem od sebe oddělit. Gely se
prodávají pod různými komerčními názvy. Jedním z nejpopulárnějších materiálů je
Sephadex, dextran zesíťovaný pomocí epichlorhydrinu. Sepharosa je vyráběna z agarosy,
polymeru D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Oproti Sephadexu je Sepharosa
vhodná i pro dělení větších makromolekul aţ do molekulové hmotnosti 40,000 kDa, u
Sephadexu je to maximálně 750 kDa. Krom materiálu a velikosti pórů se dodávané
nosiče liší i velikostí částic, která se pohybuje od 10 do 300 μm. Superdex a Superosa
odpovídají svým materiálovým sloţením Sephadexu, resp. Sepharose. Oproti nim
poskytují lepší výsledky, avšak jsou výrazně draţší. Pouţívají se tedy jen v případech,
kdy je kladen velký důraz na kvalitu separace.
Vzhledem k tomu, ţe zde nedochází ke specifickým interakcím, ani není potřeba
měnit náboj separovaných molekul, pouţívá se isokratická mobilní fáze. Důleţité však je,
aby mobilní viskozita mobilní fáze nebyla výrazně niţší neţ viskozita vzorku; doporučuje
se, aby byla minimálně poloviční. To vytváří problémy zejména při obsahu glycerolu ve
vzorku, a nikoliv v mobilní fázi či při vysoké koncentraci biopolymerů.
Gelová filtrace je často pouţívaná analyticky, zejména pro stanovení molekulové
hmotnosti nativních proteinů. V tomto případě se experiment provádí nejméně dvakrát.
Jednou pro kalibraci, kdy se jako vzorek pouţije směs standardních proteinů známé
molekulové hmotnosti, a minimálně jednou při samotném měření molekulové hmotnosti
vzorku. Do grafu se pak zanáší dekadický logaritmus molekulové hmotnosti polymeru na
osu x a poměr elučního objemu k mrtvému objemu na osu y. Z regresní přímky se
pomocí rovnice
Ve/V0 = - a.log Mr + b,
ve které jsou a a b jsou empirické konstanty, vypočítá molekulová hmotnost polymeru.
Hydrofobní chromatografie
Mnohé molekuly obsahují na svém povrchu nepolární hydrofobní oblasti. Rozdílů
mezi nepolárním charakterem molekul se vyuţívá i pro jejich separaci. Nízkomolekulární
96
látky jsou na základě toho separovány adsorpční chromatografií, zatímco pro
makromolekuly se pouţívá hydrofobní chromatografie (HIC). Tento typ chromatografie
vyuţívá jako nosiče stacionární fáze hydrofilní gely, na nichţ jsou navázány nepolární
alkylové či arylové skupiny. Jedná se často o methyl, oktyl, oktadecyl či fenyl. Tím je
hydrofobní chromatografie shodná s chromatografií na reverzní fázi. Obě metody se však
liší stupněm substituce hydrofilního gelu. V případě hydrofilní chromatografie je
koncentrace substituovaných skupin v rozmezí od 10 do 50 μmol.ml-1 gelu,
u chromatografie na reverzní fázi je substituce přibliţně o řád vyšší. Rovněţ eluční roztok
se u obou chromatografií liší. Pro hydrofobní chromatografii je pouţíván roztok niţší
iontové síly a bez organických rozpouštědel typických pro chromatografii na reverzní
fázi.
Vazba proteinu k matrici závisí na mnoha faktorech. Z vlastností matrice se jedná
především o její funkční skupiny a stupeň derivatizace, z vlastností polymerů pak
zejména o velikost a charakter hydrofobní části povrchu. Proteiny s větší hydrofobní částí
povrchu jsou vázány těsněji neţ proteiny s menším hydrofobním regionem. Těsnější
vazbu k hydrofobním regionům vykazují alkylové substituenty, u kterých se těsnost
vazby zvyšuje s délkou řetězce. Těsnější vazby se docílí i pouţitím matrice s vyšším
stupněm derivatizace. Matrice pro hydrofobní chromatografii dosahují velké kapacity
záchytu polymerů. Podle typu matrice, mobilní fáze a polymeru se můţe na 1 g gelu
zachytit aţ 50 mg polymeru.
Vznik a pevnost hydrofobních vazeb polymerů k matrici velmi závisí na pouţité
mobilní fázi. Vyšší koncentrace soli zvyšuje pevnost vazby polymerů k matrici. Mimo
koncentraci je důleţitá i volba konkrétní soli v mobilní fázi. Pro kationty i anionty byla
vypracována Hofmeisterova řada iontů:
NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+
PO43– > F– ~ SO42– > HPO42– > CH3COO– > Cl– > Br– > NO3– > I– > SCN–.
Tato řada srovnává ionty podle jejich podpory vazby polymeru k matrici. Obě
uvedené řady obsahují jen několik významnějších iontů, ačkoliv byl studován vliv mnoha
jiných, které byly rovněţ zařazeny do Hofmeisterovy řady. Ionty v levé části řady navíc
zvyšují stabilitu proteinů. Obojí je dáno zvýšením organizovanosti molekul vody v okolí
iontu, kdy voda obaluje jednotlivé ionty v několika vrstvách. Na průběh hydrofobní
chromatografie má vliv i hodnota pH mobilní fáze, avšak vliv změny pH je často
nepředvídatelný.
Mobilní fází je obvykle pufr s obsahem vhodné soli, často se jedná
o fosforečnanový pufr nastavený na pH 7,0 s 1M (NH4)2SO4. Eluce se zajišťuje
97
postupným sniţováním koncentrace soli. Často je navíc usnadňována přídavkem
organických látek, zejména glycerolu či neionogenních detergentů.
Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant
Pro odstranění nízkomolekulárních komponentů, např. Síranu amonného
z precipitace proteinů, se pouţívají dvě podobné metody, dialýza a ultrafiltrace. Obě
metody jsou zaloţeny na stejném principu. Jedná se o průchod malých molekul přes
membránu s póry s přesně definovanou velikostí. Ta určuje, jak velké molekuly jsou
membránou zachyceny a jak velké molekuly jsou schopny projít přes membránu. Tato
hranice je důleţitou charakteristikou membrány, kterou je nutné vzít při volbě membrány
v úvahu a je označována jako cut-off value. Její hodnota se udává v kDa a je míněna pro
globulární proteiny, které při vyšší molekulové hmotnosti prochází přes membránu jen
velmi pomalu, nebo neprochází vůbec.
Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá v síle, která pohání transport
molekul přes membránu. V případě dialýzy se jedná o prostou difuzi přes membránu,
zatímco v případě ultrafiltrace je průchod roztoku přes membránu poháněn vnějším
tlakem. Ultrafiltrace je proto rychlejší neţ dialýza.
Dialýza.
Nejjednodušším provedením dialýzy je pouţití dialyzačního střívka naplněného
dialyzovaným roztokem, které se vloţí do nádoby s dialyzačním roztokem, do kterého se
difuzí přesouvají nízkomolekulární komponenty. Vzhledem k vyšší koncentraci
rozpuštěných látek v dialyzovaném roztoku uvnitř střívka můţe zároveň dojít ke vstupu
rozpouštědla do střívka a následnému nárůstu jeho objemu. Proto je nutné plnit střívko
jen částečně. Dialyzační roztok by měl obsahovat pufr, který stabilizuje jeho pH na
poţadované hodnotě.
Rychlost difuze lze určit pomocí Fickova zákona. Podle něj záleţí na ploše, přes
kterou difuze probíhá, koncentračním gradientu a difuzní konstantě závislé na velikosti
a tvaru částice. Dialýza je poměrně zdlouhavá metoda, která probíhá obvykle 12 aţ 24
hodin. Ukončení dialýzy lze detekovat měřením konduktivity dialyzačního roztoku.
Dialýzu lze urychlit výměnou dialyzačního roztoku za čistý.
Membrány a střívka pro dialýzu se obvykle vyrábí z celulosy a jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí 1 aţ 50 kDa. Pro dialýzu malých objemů do 1 ml lze pouţít
buď komerčně vyráběné mikrodialyzační komůrky, nebo je moţné je vyrobit přímo v
laboratoři z ependorfových trubiček odstraněním víčka a překrytím jejich konců
dialyzační membránou, kterou je nutné dobře upevnit.
98
Dialýzu lze pouţít i pro zakoncentrování roztoku makromolekul. V tomto případě
se vyuţije polyetylen glykol přidaný do dialyzačního pufru, který postupně nasává vodu
a zvětšuje svůj objem.
Pro odstranění nízkomolekulárních látek lze kromě dialýzy pouţít i obdobnou
metodu, ultrafiltraci či gelovou filtraci. Ty jsou sice rychlejší, ale rovněţ náročnější na
laboratorní vybavení a zručnost.
Ultrafiltrace.
Ultrafiltrace se ve svém principu podobá dialýze do té míry, ţe je moţné pro ni
pouţít dialyzační střívko umístěné v nádobě připojené k vakuové pumpě. Přesto je
výhodnější pouţít membránu určenou přímo pro ultrafiltraci. Membrána pro ultrafiltraci
se skládá ze dvou vrstev. První, obrácená směrem k ultrafiltrovanému roztoku, je tenká a
obsahuje póry s přesně definovanou velikostí. Druhá vrstva je širší a obsahuje větší póry,
jejichţ velikost jiţ nemusí být přesně určena. Při sestavování ultrafiltrační komůrky je
důleţité dbát na správnou orientaci membrány; strana přivrácená směrem k roztoku bývá
obvykle hladší a při pohledu proti světlu se více leskne.
V současnosti se vyrábí různé druhy membrán pro ultrafiltraci. Jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí od 0,5 kDa po 1000 kDa (membrána Millipore PCXK).
Jednotlivé membrány se od sebe liší i materiálem, ze kterého jsou vyráběny. Je moţné
zakoupit membránu z acetátu celulosy, regenerované celulosy, hydrofilních polymerů,
syntetických polymerů či inertních polymerů.
Do pórů membrány jsou samozřejmě tlačeny i molekuly, jejichţ hmotnost
přesahuje hodnotu cut-off. Menší z nich mohou velmi pomalu projít přes membránu, jiné
se však v pórech zapříčí a ucpou je. Aby k tomu nedocházelo, je při kaţdé ultrafiltraci
pouţito magnetické míchadlo. Jedná se o oblý tyčový magnet, který se vlivem otáčení
magnetu v míchačce, na kterou je ultrafiltrační komůrka poloţena, otáčí a zajišťuje tak
míchání kapaliny v ultrafiltrační komůrce. Elektromagnetické míchadlo se samozřejmě
spolu s míchačkou nevyuţívá jen při ultrafiltraci, ale všude tam, kde je třeba zajistit
míchání roztoku.
Na rozdíl od dialýzy je při ultrafiltraci pro urychlení procesu rozpouštědlo hnáno
přes membránu tlakem. Tento tlak můţe být vytvořen přetlakem inertního plynu,
nejčastěji dusíku, v ultrafiltrační komůrce, vakuem v nádobě pro zfiltrovaný roztok či
centrifugací. Je-li makromolekulární látka, kterou chceme zahustit či odsolit, odolná vůči
oxidaci vzdušným kyslíkem, je moţné pouţít k vytvoření tlaku v komůrce namísto
dusíku vzduch. Pro ultrafiltraci prováděnou při centrifugaci se vyrábí zvláštní kyvety pro
pouţití v rotorech s fixním úhlem. Tyto kyvety umoţňují v relativně krátké době
zahuštění z několika ml i na méně neţ 100 μl.
99
Je-li účelem ultrafiltrace sníţení koncentrace nízkomolekulárních látek v roztoku,
přidává se k tomuto roztoku další roztok, který tyto kontaminanty neobsahuje, a tento
roztok se zahustí na poţadovaný objem. Tím dojde ke sníţení koncentrace kontaminantu
v koncentrátu. Je-li potřeba výrazné sníţení koncentrace kontaminantů, je výhodnější
pouţít opakovanou ultrafiltraci menším objemem neţ jednu ultrafiltraci menším
objemem. Chceme-li například sníţit koncentraci kontaminantu v 5 ml roztoku na 1 %
původní koncentrace, potřebujeme při jedné ultrafiltraci přidat 495 ml čistého roztoku,
zatímco při 2 ultrafiltracích pouţijeme vţdy jen 45 ml čistého roztoku a při čtyřech
ultrafiltracích jen po 11 ml roztoku. Spotřeba roztoku tak při dosaţení stejného výsledku
činí jen 18, resp. 9 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Výhodnost opakované
ultrafiltrace stoupá s rostoucím poměrem mezi původní a poţadovanou koncentrací
ultrafiltrovaného roztoku. Bude-li třeba sníţit koncentraci nízkomolekulárních
kontaminant na setinu procenta, bude spotřeba promývacího roztoku při 2, resp. 4
ultrafiltracích činit jen 2, resp. 0,4 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci.
Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu
Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou
Získání rekombinantního proteinu v aktivní a vysoce čisté formě je jedním ze
základních metodik biotechnologického výzkumu. Při přípravě těchto proteinů se vyuţívá
fúzních proteinů, jejichţ součástí je sekvence aminokyselin, která umoţňuje jejich
purifikaci. Tyto sekvence však mohou omezovat biologickou aktivitu sledovaného
proteinu. Odštěpení těchto sekvencí pomocí specifických endoproteáz, enzymů štěpících
určitou aminokyselinovou sekvenci, je často nezbytné pro další vyuţití cílového proteinu.
Specifické endoproteasy minimalizují nechtěné nespecifické štěpení, které se vyskytuje
při štěpení fúzních proteinů chemickými látkami (bromkyan, hydroxylamin, pH).
Příkladem specifických endoproteas je enterokinasa rozpoznávající aminosekvenci
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓X-, dále pak prolin, specifické endoproteasu hydrolyzující peptidy,
endoproteáza AspN selektivně štěpící peptidové vazby mezi N-koncem a kyselinou
aspartámovou, faktor Xa štěpící sekvenci Ile-Glu(nebo Asp)-Gly-Arg↓ nebo trombin
štěpící sekvenci Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser.
Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu
Purifikace fúzních a následně rekombinantních proteinů je proces zahrnující
několik na sebe navazujících chromatografických purifikací, které musí být vţdy
optimalizovány. Pro zjednodušení tohoto procesu byla vyvinuta jednokroková afinitní
purifikace fúzního proteinu, tedy cílového proteinu značeného afinitní koncovkou
připojenou na n- nebo c- konec rekombinantního proteinu. Jako afinitní koncovka jsou
100
úspěšně pouţívány malé peptidy, např. Poly-His, poly-Arg, c.myc, Flag, nebo velké
peptidy, např. Glutation s transferasa, doména váţící chitin. Abychom zajistili
biologickou aktivitu rekombinantního proteinu, musíme tuto koncovku odstranit před
jeho samotným vyuţitím. Z tohoto důvodu je mezi rekombinantní protein a koncovku
umístěna krátká aminokyselinová sekvence, která je rozpoznávána specifickou
endoproteázou. Tento způsob přípravy rekombinantního proteinu má několik omezení:
1. Odseparování proteinu od fúzní koncovky a pouţité endoproteasy vyţaduje další
purifikační krok. 2. Pouţité proteasy nejsou zcela specifické a mohou částečně štěpit
cílový protein. 3. Štěpené místo můţe být nepřístupné pro endoproteasu. 4. Štěpení
vyţaduje dlouhý reakční čas a je drahé.
K překonání uvedených omezení byl vyvinut samoštěpící systém, kdy je tzv. Self
processing modul umístěn mezi cílový protein a afinitní kotvou. Po navázání fúzního
proteinu na kolonu a odmytí všech kontaminujících nečistot je štěpící aktivita
samoštěpícího modulu aktivována malou molekulou a vyúsťuje v uvolnění
rekombinantního proteinu s tím, ţe afinitní koncovka včetně samoštěpící modulu zůstává
na koloně. Vhodný samoštěpící modul splňuje následující podmínky: 1. Štěpí pouze
vazbu mezi cílovým proteinem a tímto modulem. 2. Není aktivován in vivo, pouze po
cílené indukci in vitro.
Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování
Přirozeně produkované proteiny jsou v buňce bezprostředně po translaci skládány
do své nativní struktury. Ta je však v mnoha případech heterologní exprese (například
eukaryontní proteiny exprimované v mikroorganismech) či po denaturační purifikaci
narušena. Nesprávně sloţené proteiny vytváří v bakterii (pro nás nejdůleţitější je E. coli)
nerozpustné agregáty, tzv. Inkluzní tělíska. Ve formě inkluzních tělísek se tak vyskytují
aţ tři čtvrtiny proteinů biotechnologicky exprimovaných v E. coli. Za stabilitu nativní
konformace i za vznik inkluzních tělísek z nesprávně sloţených proteinů a jejich agregátů
jsou odpovědny stejné typy interakcí. Jedná se o hydrofobní interakce mezi nepolárními
vedlejšími řetězci aminokyselin uvnitř proteinu či inkluzního tělíska, iontové interakce a
kovalentní či vodíkové vazby. Důvod vzniku inkluzních tělísek dosud není plně objasněn,
ale předpokládá se, ţe proteiny jsou exprimovány ve větším mnoţství, neţ je kapacita
bakteriální buňky pro jejich správné skládání. Z toho vyplývají moţnosti, jak se tvorbě
inkluzních tělísek vyhnout. Často je účinné sníţení teploty pro kultivaci exprimujících
buněk z 37ºC na pokojovou teplotu a patřičné prodlouţení doby exprese či pouţití lowcopy expresního plasmidu. Náročnější metodou je koexprese chaperonů potřebných pro
skládání proteinu do správné konformace (u E. coli hlavně molekuly GroEl a GroEs).
V některých případech se osvědčil krátký tepelný šok (42°C), po kterém dochází
v exprimujících buňkách k přechodnému zvýšení exprese proteinů tepelného šoku
zvyšujících stabilitu nascentních proteinů. Příznivý vliv na rozpustnost proteinů můţe mít
101
také typ připojené značky (Tagu). Fúze s doménovými nebo proteinovými značkami
(celulose binding domains, glutathione s-transferase tag (GST), maltose-binding protein
(MBP), thioredoxin (TRXA), transcription termination anti-termination factor (NUSA),
protein disulfide isomerase i) často zvyšuje rozpustnost a stabilitu rekombinantních
proteinů. Navíc některé značky jsou s výhodou pouţitelné pro afinitní purifikaci. Kvůli
své velikosti ale pro většinu aplikací musejí být z proteinu po purifikaci odstraněny.
V současné době je také moţno pouţít speciální kmeny E. coli geneticky upravené pro
expresi eukaryotických proteinů jako je kmen RossetaTM nesoucí geny pro tRNA
rozeznávající kodony vzácné v E. coli, kmen OrigamiTM mutovaný v genech pro
thioredoxin reduktasu a glutathion reduktasu umoţňující tak tvorbu disulfidických
můstků v cytoplasmě nebo kmen Rrosseta-GamiTM kombinující obě tyto vlastnosti.
Obrázek 5.1. Inkluzní tělíska v elektronové mikroskopii
Inkluzní tělíska (označená šipkami) u kultury E. coli. (převzato
z www stránek Working group downstream processing at the
Department of biotechnology, University of Natural Resources
and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria).
Z inkluzních tělísek je moţné získat funkční a správně sloţený protein a to často
ve vyšší čistotě a koncentraci, neţ jakou můţeme dosáhnout při expresi proteinu za
podmínek, kdy se inkluzní tělíska netvoří. Postup, který umoţňuje převést protein
102
z inkluzních tělísek do nativní plně funkční podoby se nazývá refoldování. Jelikoţ není
k dispozici univerzální refoldovací pufr a výsledek refoldování je poměrně nejistý,
vyuţívá se při produkci proteinů jen omezeně. Ačkoliv je refoldování poměrně levné a
rychlé, mnoho pracovníků při expresi proteinu v nerozpustné formě volí změnu
expresního systému. V současnosti je moţno z inkluzních tělísek refoldovat více neţ
polovinu proteinů. Pro ověření správné konformace získaného proteinu je třeba mít
k dispozici nástroj potvrzující, ţe produkt je refoldování převeden do nativní formy. Je
moţno vyuţít:
- stanovení enzymové aktivity
- ověření imunogenity experimentální vakcinací
- stanovením reaktivity s protilátkami proti konformačním epitopům
- ověření vazby na receptor nebo ligand
- pouţití spektroskopických metod
Obrázek 5.2. Schéma purifikace proteinu z inkluzních tělísek
Inkluzní tělíska
Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid,
Mercaptoethanol, detergenty)
Purifikace za denaturačních podmínek
(afinitní chromatografie)
Čistý denaturovaný solubilní protein
Renaturace
103
Čím více je o daném proteinu známo, tím větší je pravděpodobnost úspěchu.
Postup pro refoldování některých proteinů lze nalézt v databázích refoldování, jako je
např. Refold, který je k dispozici na internetových stránkách melbournské univerzity
monash (http://clims.med.monash.edu.au/).
Inkluzní tělíska lze získat z buněk jejich lyzováním, centrifugací a promytím
pelety roztokem tritonu x-100 nebo deoxycholátu. Rozpuštění (solubilizace) inkluzních
tělísek vyţaduje narušení interakcí, které se podílejí na jejich vzniku a stabilitě. Toho je
moţné dosáhnout přídavkem chaotropních činidel (8M močovina, 8M hydrochlorid
guanidinu apod.) Či detergentů (sarkosyl, SDS apod.) A redukčních činidel (2merkatoethanol nebo dithiotreitol). Rychlejší a účinnější solubilizace se dosáhne pouţitím
hydrochloridu guanidia, zatímco močovina je výhodnější při nanášení na gel pro SDSPAGE elektroforézu. Proto se v mnoha protokolech v průběhu purifikace přechází
z hydrochloridu guanidinu na močovinu, coţ můţe být provedeno např. při
chromatografické purifikaci, kdy je na kolonu nanesen vzorek v roztoku hydrochloridu
guanidinu, ale eluční pufr obsahuje močovinu.
Samotné renaturaci často předchází purifikace denaturovaného proteinu.
Nejvýhodnější je pouţití afinitní chromatografie v případě, ţe obsahuje polyhistidinovou
značku, naopak problematické můţe být pouţití hydrofobní či iontoměničové
chromatografie.
Při renaturaci jsou solubilizační činidla odstraněna a nahrazena pufrem, jenţ
podporuje správné sloţení proteinu do aktivní formy a umoţňuje následné pouţití
proteinu, tj. Má pokud moţno fyziologické pH a osmotický tlak. Je-li protein jednou
správně sloţen, můţe být obvykle pro další pouţití rozpuštěn v různých pufrech.
Jedna z prvních metod refoldování v roztoku vyuţívala dialýzu. Protein
v dialyzačním střívku je ve více krocích dialyzován za pouţití pufrů, které se svým
sloţením postupně přibliţují finálnímu refoldovacímu pufru. Při průtokové metodě se
sloţení pufru nemění skokově, ale plynulým gradientem. Tato metoda vyţaduje desítky
hodin a řádově litry pufrů.
Nejdynamičtěji se rozvíjející metodou refoldování je rychlá diluční metoda, která
je při nulových či nízkých zkušenostech s refoldováním nejvýhodnější. Protein se
postupně po malých dávkách přidává do nadbytku nativního pufru za stálého míchání..
Jsou-li podmínky ideální, protein se po zředění v průběhu několika sekund správně sloţí
do nativní konformace.
Odstranění solubilizačních činidel a jejich nahrazení nativním pufrem můţe být
také provedeno přímo na koloně při afinitní purifikaci, kdy eluován je jiţ refoldovaný
protein.
104
Do renaturačních pufrů se často přidávají aditiva, sniţující agregaci proteinů
a/nebo usnadňující tvorbu disulfidických vazeb. Patři mezi ně hlavně arginin (0,5 – 1m),
glycerol, oxidovaný a redukovaný glutathion, dithiotreitol, polyethylen glykol,
detergenty, edta atd. Efektivita aditiv je jen obtíţně predikovatelná a jejich účinnost je
nutno ověřovat empiricky. Je také moţno zakoupit komerční „refoldovací kity“
obsahující různé koncentrace a poměry aditiv, které mohou poskytnout za spotřeby
minima vzorku cenné informace pro refolding ve větším měřítku.
Metody sušení produktů
Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů
Proteiny jsou amfifilní molekuly, tedy molekuly mající jak hydrofobní, tak
hydrofilní skupiny. Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích úzce souvisí s jejich
aminokyselinovým sloţením a jejich solvatačním obalem, tj. Vrstvou molekul vody
a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinnou solvatačního obalu jsou elektrostatické
síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se
s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází
maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením
iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymeru – dochází ke sníţení interakce
nabitých skupin biopolymeru mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším
přídavkem neutrální soli se sniţuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace
vody, a tím se sniţuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na
koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou pH,
nejniţší je rozpustnost v izoelektrickém bodě. Při frakcionaci organickými rozpouštědly
mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se vyuţívá rozdílná rozpustnost proteinu
v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace organického rozpouštědla se
zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinu, coţ nakonec vede k jejich vysráţení.
Frakcionace organickými rozpouštědly se můţe kombinovat se změnami koncentrace
solí, pH a teploty.
Proteiny i nukleové kyseliny jsou vysoce senzitivní, nepatrná změna některé
z podmínek můţe způsobit jejich denaturaci, degradaci nebo změnu vlastností, které jsou
nutné pro úspěšnou krystalizaci. Z tohoto důvodu musí být proteiny v hydratované formě
udrţovány při konstantním pH a teplotě.
Krystaly makromolekul
Obsahují průměrně 50 % rozpouštědla, většinou mají charakter gelu s mnoha
intersticiálními prostory, kterými můţe proudit rozpouštědlo nebo difundovat malé
105
molekuly. Mříţkové interakce (solné můstky, vodíkové vazby, hydrofobní interakce)
udrţují integritu krystalu a vysvětlují rozdíly mezi vlastnostmi a schopností krystalizace
u malých molekul a biomakromolekul. Vysoká neuspořádanost, gelový charakter, vysoká
senzitivita na změny teploty, pH, druh rozpouštědla či iontovou sílu jsou hlavní příčinou
slabých difrakčních vlastností krystalů makromolekul. Krystaly jsou křehké, slabým
tlakem se rozpadají, na vzduchu hydratují, vykazují slabé optické vlastnosti. V průběhu
expozice radiačního záření dochází k silnému poškození krystalů, proto je nutné provádět
měření na difraktometrech s plošným detektorem, resp. Na vysokofrekvenčných zdrojích
rentegenového záření, tzv. synchrotronech.
Krystaly biologických makromolekul jsou při laboratorní teplotě vysoce citlivé
k rentgenovým paprskům a často podléhají radiačnímu poškození, zejména při pouţití
synchrotronového záření s vysokou intenzitou. Většinou je toto poškození tak rychlé, ţe
k nasnímání nezbytného mnoţství difrakčních dat je potřeba několika různých krystalů
a někdy dokonce není moţné měření provést. V současné době se pouţívá metoda
kryokrystalografie, tedy měření difrakce za velmi nízkých teplot (100 °K).
Sušení za zvýšené teploty – sušárny, sprejové sušení
Sušení za snížené teploty – evaporační centrifugace, lyofilizace
Speciální část frakcionace biopolymerů HA
Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů – kyselou hydrolýzou
Biomakromolekuly jsou sloţeny z menších molekul, které se v organismech
vyskytují i samostatně. Mezi těmito molekulami se odštěpením vytváří vazba, coţ
umoţňuje tvorbu dlouhých řetězců těchto molekul a tvorbu makromolekulárních látek.
Jedná se např. O peptidovou vazbu mezi aminokyselinami v peptidech a proteinech či
glykosidovou vazbu mezi monosacharidovými jednotkami v oligosacharidech
a polysacharidech. Za určitých podmínek lze tuto vazbu dodáním molekuly vody
opětovně rozštěpit. Tato hydrolytická reakce můţe být specifická, kdyţ dochází ke
štěpení pouze konkrétních vazeb mezi podjednotkami např. za konkrétní aminokyselinou
v proteinu, nebo nespecifická, kdyţ je štěpena vazba mezi libovolnými monomerními
jednotkami.
Polysacharidy je moţné štěpit více metodami. Velmi často je vyuţívána
enzymatická hydrolýza. Ta je katalyzována enzymy označovanými glykosidasy (EC
3.2.x.x) ze třídy hydrolas. Patrně nejznámější glykosidasou je ptyalin ze slinných ţláz –
α-amylasa (EC 3.2.1.1), která štěpí škrob.
106
Další moţností štěpení polysacharidů je vyuţití kyselé hydrolýzy. Její postup se
pro různé polysacharidy liší, v závislosti na rozpustnosti polysacharidu můţe být
heterogenní nebo homogenní. Základním principem je vazba protonu na kyslík
glykosidové vazby. Ta je následována nukleofilním atakem molekuly vody na sousední
uhlík a substitucí původního kyslíku.
Kyselinu hyaluronovou lze hydrolyzovat např. V 0,4 m HCl, ke které byl pro
stabilizaci pH na hodnotě 1,44 přidán ekvimolární roztok KCl, KH2PO4, tetraboritanu
sodného, tris-(hydroxyl-methyl)-aminoethanu a kyseliny citronové. Reakce probíhá při
teplotě 60°C několik dní. Molekula obsahuje dva uhlíky náchylné k hydrolýze, jedná se o
uhlíky C1 a C4. V případě uhlíku hydrolýzy u uhlíku C1 existují dva rozdílné
mechanismy. Proton můţe atakovat nejen glykosidovou vazbu, ale i heterocyklický
kyslík cukerné kostry.
Kyselina alginová je podobně jako celulosa hydrolyzována v 85% H3PO4
v poměru 18,8 ml kyseliny na 1 g polysacharidu. Jedná se o heterogenní reakci,
probíhající za laboratorní teploty po dobu několika dnů. Produkt se získá filtrací, přičemţ
polysacharidy o vyšší molekulové hmotnosti jsou zachyceny filtrem, produkty niţší
molekulové hmotnosti je moţné vysráţet vodou či methanolem a opět oddělit filtrací. Pro
hydrolýzu síranových polysacharidů (karagenany, heparin, síranové estery dextranu) při
teplotě 55 °c je moţné pouţít pufr sestávající z 12 mM HCl a 8 mM LiCl o hodnotě pH
2,0.
Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením
Výchozí sloţkou pro přípravu oligosacharidů jsou polysacharidy. Přípravu je
moţné provádět kyselou hydrolýzou (pH 4), kdy účinnost hydrolýzy je sledována pomocí
metody SEC-MALS. Po skončení kyselé hydrolýzy roztok zneutralizujeme NaOH a
následně zbavíme připravené oligosacharidy nízkomolekulárních nečistot pomocí
ultrafiltrace.
Tuto metodu lze modifikovat pouţitím enzymů endoglykosidas, které štěpí
pouţitý polysacharid v kyselém prostředí. Příkladem endoglykosidasy je například Endoβ-N-acetylhexosaminidasa, která štěpí GalNAc-Glc vazby v polysacharidech. Dalším
příkladem je Endo-β-glukuronidasa, která štěpí Glc–GalNAc vazby.
107
6. OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL
Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je nezbytný nástroj pro
purifikaci a charakterizaci makromolekul. Výběr chromatografické metody je spojen
s typem sledované molekuly a také s cílem výzkumu. Všechny uvedené chromatografické
metody mohou být prováděny jako izokratická nebo gradientová eluce v kvalitativních
nebo kvantitativních analýzách.
V současné době je pouţíváno 8 základních modelů HPLC pro analýzu
a purifikaci peptidů a proteinů. Tyto metody zahrnují gelovou permeační chromatografii
téţ nazývanou vylučovací chromatografie (HP-SEC), iontově výměnnou chromatografii
(HP-IEX), chromatografii na normálních fázích (HP-NPC), chromatografii na reverzních
fázích (RP-HPLC), hydrofobní interakční chromatografie (HP-HIC), hydrofilní
interakční chromatografii (HP-HILIC), chelatační afinitní chromatografii (HP-IMAC), a
bioafinitní chromatografii (HP-BAC).
Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod
Chemická organizace a sloţená struktura aminokyselinového řetězce jsou
základní vlastnosti, které určují způsob a typ chromatografické separace.
Chromatografická separace úzce souvisí se strukturou a chemickými vlastnostmi
postraních řetězců jednotlivých aminokyselin. Chemická diversita proteinů je navíc
zvětšována posttranslačními modifikacemi s karbohydráty a lipidy. Polární postranní
řetězce aminokyselin jsou rozděleny do tří skupin – bez náboje, s pozitivním nábojem
nebo téţ bazické a s negativním nábojem neboli kyselé. Peptidy a proteiny obsahují různé
mnoţství ionizovatelných bazických a kyselých skupin. V závislosti na těchto
vlastnostech má kaţdý peptid a protein charakteristický izoelektrický bod, jehoţ hodnota
se odvíjí od typu pouţitého rozpouštědla (jeho pH, sloţení a teploty). Zvláštní skupinu
tvoří cyklické peptidy bez ionizovatelných postraních řetězců, které mají nulový náboj.
Mnoţství a rozloţení nabitých skupin bude ovlivňovat polarizaci a ionizaci
peptidů a proteinů. Tyto faktory určují výběr optimálních separačních podmínek pro
rozdělení peptidů a proteinových směsí. Tyto informace jsou přímým vodítkem pro
zvolení typu eluentu a uspořádání HPLC.
Parametry mobilní a stacionární fáze
Parametry mobilní a stacionární fáze přímo ovlivňují vlastnosti polypeptidů nebo
proteinů v průběhu kapalinových chromatografických separací. Ve vodných roztocích
108
dochází k internalizaci hydrofobních reziduí, a tím k stabilizaci struktury, coţ je základní
předpoklad pro chromatografické separace. Určení proteinových struktur včetně
autoagregací je nezbytné pro správnou interpretaci výsledků získaných HPLC.
Kritickým faktorem pro selekci HPLC je výběr experimentálních podmínek, které
ovlivní konformační stav biomakromolekul. Konformační stabilita proteinů můţe být
ovlivněna mnoha způsoby (mobilní a stacionární fází, teplotou), v mnoha případech pak
integrovanou experimentální a detekční strategií. Nejčastěji jsou pouţívány: 1H 2dimensionální NMR, infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR),
hmotnostní spektrometrie s elektrosprejem (ESI-MS), cirkulární dischroismus, optická
rotační disperze – které jsou nutné k určení nadstruktur polypeptidového řetězce
v roztoku nebo v přítomnosti specifických ligandů.
Detekce peptidů a proteinů HPLC
UV detekce je nejpouţívanější metodou pro detekci peptidů a proteinů v HPLC,
jelikoţ peptidové vazby absorbují v ultrafialové (UV) oblasti spektra (205 to 215 nm).
Aromatické aminokyseliny absorbují v daleké UV oblasti nad 250 nm. Znalost uv spektra
a částečně extinkčních koeficientů nepřekrývajících se absorpčních minim těchto
aminokyselin umoţňuje UV -diodová detekce (DAD). Znalost relativní UV/VIS
absorbance peptidů a proteinů je nezbytná pro výběr správné detekční vlnové délky v RPHPLC a v dalších HPLC módech. Společné pouţití 215 nm jako preferované vlnové
délky pro většinu analytických reverzních fází s peptidy nebo proteiny je dobrým
kompromisem mezi detekcí senzitivity a potenciální detekcí interference způsobené
absorpcí pufru. Nicméně vlnové délky mezi 230 a 280 nm jsou často pouţívané
v preparativních aplikacích, kde pouţití více senzitivní detekce můţe vyústit v přehlcení
detektoru.
Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie)
Podstatou metod zaloţených na afinitní interakci je tvorba stabilního,
specifického komplexu mezi ligandem a bílkovinou (biologicky aktivní látkou
a protilátkou). Ligandem můţe být látka vysokomolekulární i nízkomolekulární povahy.
Afinitní interakci představuje soubor různých interakcí –polárních, elektrostatických,
hydrofobních i Van der Waalsových. Intenzita afinitní interakce mezi bílkovinou a
ligandem můţe být vyjádřena pomocí disociační konstanty KD. Hodnota disociační
konstanty by se měla pohybovat zhruba v rozmezí 10-8 aţ 10-4 mol.L-1 . Nejčastěji
vyuţívané afinitní páry protein-ligand uvádí následující přehled:
Enzym – substrát
Enzym –inhibitor
109
Protilátka –antigen
Lektin –sacharid
Avidin –biotin
Lecithin –glykoprotein
Vazebný protein –hormon
Afinitní chromatografie je zaloţena na interakci mezi bílkovinou a ligandem
imobilizovaným na chromatografickém sorbentu. Experimenty lze provádět v reţimu
HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Pouţívaný sorbent bývá umístěn v
chromatografické koloně nebo je přímo přidán do roztoku vzorku. Při chromatografické
analýze se obvykle nejprve vymyjí balastní bílkoviny a následovně je eluována
poţadovaná purifikovaná bílkovina. Afinitní chromatografie je vysoce selektivní
metodou, umoţňuje separovat velice sloţité směsi bílkovin. Nevýhodou afinitní
chromatografie bývá nízká kapacita a vysoká cena afinitních sorbentů
Gelová permeační chromatografie (SEC)
Metoda je zaloţena na nerovnováţném ději – na sítovém efektu. Separace je zde
závislá na velikosti a tvaru částic analyzované látky a stacionární fáze. Mobilní fáze
pouze unáší analyty kolonou, separačního procesu se přímo neúčastní. Velké molekuly
(makromolekuly) nepronikají do pórů gelu a elují se jako první (tM). Malé molekuly
pronikají do pórů gelu, jejich pohyb kolonou se zpomaluje. Experimenty lze provádět
v reţimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Vylučovací kolony mají omezenou
kapacitu, pouţívají se dlouhé kolony. Vylučovací limit = velikost částic, které jiţ
nebudou pronikat do pórů a nebudou separovány na vylučovací koloně. Agarosové
a dextranové gely se nehodí pro HPLC, neboť nevydrţí vysoké tlaky. Většinou se jako
gel pouţívají organické polymery (kopolymer styren + divinylbenzen). Vhodné je téţ
pouţití porézních rigidních skel a silikagelu. Mobilní fáze musí rozpouštět analyty, nesmí
reagovat se soluty ani se stacionární fází, musí smáčet povrch stacionární fáze a být
kompatibilní s detektorem. Často pouţívanou mobilní fází je voda a vodné roztoky pufrů.
Iontově výměnná chromatografie
Iontově výměnná chromatografie probíhá na iontoměničích. Je zaloţena na
silných elektrostatických silách mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče a ionty
v mobilní fázi.
Při technice iontové výměny jde o separaci iontů, proto je vţdy pouţívána vodná
mobilní fáze. Stacionární fáze (iontoměnič , ionex) je zpravidla makromolekulární
matrice obsahující kyselou nebo bazickou funkční skupinu. Katexy jsou iontoměniče s
110
kyselou funkční skupinou (sulfo-kyselina, karboxylová kyselina) nesoucí záporný náboj,
anex obsahuje bazickou funkční skupinu (aminoskupinu) a je nositelem kladného náboje.
Ion obsaţený v ionexu bývá vyměněn za ion obsaţený v mobilní fázi nebo ve vzorku a na
principu soutěţení ionexu o tyto ionty dochází k separaci. Podobně probíhá také
ligandová výměna, kdy na iontoměniči, obvykle katexu, je zachycen iontovou výměnou
vhodný kov. Na takto upravenou kolonu se přivádí mobilní fáze obsahující látku
schopnou vytvářet s vázaným kovem iontovou vazbu.
Hydrofobní interakční chromatografie – HIC
Na hydrofobní interakční chromatografii můţe být pohlíţeno jako na nástavbu
reverzní chromatografie s vodnými mobilními fázemi bez přídavků organických
rozpouštědel. Retence solutů je ovlivňována přídavkem organických nebo anorganických
solí do vody. Chromatografie HIC byla primárně pouţita pro separaci proteinů, protoţe
v přítomnosti organických rozpouštědel v mobilní fázi vede často k denaturaci proteinů
a navíc zůstává zachována biologická aktivita proteinů. K separaci proteinů se namísto
isokratické eluce pouţívá eluce gradientová, a to gradientová eluce se sniţující se
iontovou sílou mobilní fáze (opak iontové chromatografie).
HIC se pouţívá především k separaci proteinů a velkých peptidů. Kapacita HIC je
srovnatelná s kapacitou chromatografie GPC, ale mnoţství dávkovaného vzorku je příliš
komplikované. Je to dáno tzv. vysolovacím efektem, kdy je rozpustnost proteinů ve
vysoce koncentrovaných solích omezena. Objem nástřiku není příliš velký a vzorek se
rozpouští přímo v primárním pufru, který se nastřikuje na kolonu. Je-li vzorek rozpustný
ve vodě nebo slabém pufru, pak se mohou na kolonu dávkovat pouze velmi malé objemy
vzorku, protoţe voda je v HIC velmi silnou mobilní fází. Na druhé straně však můţe mít
přídavek soli do solventu vliv na rozpustnost proteinu a můţe docházet k jeho vysráţení.
Koncentrace soli ve vzorku musí být proto optimalizována a má za následek omezení
HIC k rozšíření v preparativní chromatografii. Dalším problémem aplikace HIC je pouţití
právě vysoce koncentrovaných pufrovaných mobilních fází, coţ má za následek vysoké
nároky na pouţitou instrumentaci HPLC (čerpadla, nástřiková zařízení).
Stanovení molekulových hmotností pomocí SEC-MALS HPLC (size-exclusion
chromatography plus multi-angle light scattering)
111
Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy
Jednorozměrná denaturační elektroforéza
Je pouţívána k separaci směsi proteinů (např. z buněk, subcelulárních extraktů,
frakcí izolovaných na koloně, imunoprecipitátů), k výzkumu podjednotkových sloţení a k
verifikaci homogenity proteinových vzorků. V polyakrylamidové gelové elektroforéze
(PAGE) migrují proteiny v elektrickém poli přes póry v matrici polyakrylamidového
gelu. Velikost pórů gelového síta vzrůstá s klesající koncentrací akrylamidu. Kombinace
velikosti pórů a proteinového náboje, velikosti a tvaru determinuje migraci daného
proteinu. Za standardní elektroforézu je povaţována denaturační elektroforéza
v přítomnosti lauryl síranu sodného (SDS). Tato elektroforéza je prováděna na
vertikálních gelech o různých rozměrech. Nejčastěji jsou pouţívány minigely (6x8 cm).
Však díky své malé velikosti mají nízké rozlišení. Pouţívání minigelů je však levnější a
rychlejší.
Jednorozměrová gelová elektroforéza nám poskytuje informace o proteinech,
jejich molekulové velikosti a čistotě, taktéţ o podjednotkovém sloţení glykozylaci.
Separované proteiny mohou být z gelu získány pomocí elektroeluce a dále pouţity pro
další studie. Dalším typem gelu jsou gely ultratenké nebo gradientové. Proteiny
separované na gelech mohou být následně analyzovány imunoblotováním, přímým
barvením proteinů atd.. Velikost proteinů je posuzována podle komerčně dostupných
proteinových markerů.
Typy elektroforéz závisí na typu vzorku. Protokol na separaci malých proteinů
a peptidů poţaduje modifikaci standardních pufrů: buď Tris-tricinový pufr, nebo Tris
pufr bez urey.
SDS-PAGE vyuţívá negativního náboje SDS který obaluje proteiny. Proteiny se
pak chovají jako negativně nabité molekuly, které putují k pozitivně nabité elektrodě.
Výjimečně jsou proteiny separovány v kationtovém uspořádání elektroforéz, typickým
příkladem je separace histonů v prostředí pufru kys. octové a urey.
SDS-PAGE je obvykle prováděna za konstantního proudu. Odpor gelu vzrůstá
v průběhu separace, a s tím vzrůstá i napětí. Pokud elektroforetická nádobka obsahuje
více neţ jeden gel, pak stejný proud prochází oběma gely, ale napětí je aditivní. Tedy
pokud jeden gel má konstantních 10 mA při 100 V, pak dva identické gely mají 200 V
(100 v kaţdý). Napětí tedy limituje mnoţství gelů, které jsme schopni rozdělit na jednom
nízkonapěťovém zdroji.
Pouţitý proud téţ souvisí s tloušťkou gelu. 1.5 mm tlustý gel je obdobou dvou
0.75 mm tlustých gelů. Tím, ţe tlustší gely potřebují více proudu a tím se i více zahřívají.
Po proběhnutí SDS-PAGE je třeba proteiny vizualizovat. Pro obarvení se pouţívá
barvivo Coomassie brilliant blue. Toto barvení je navíc kvantitativní a gel je moţné
112
pouţít pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Dalším způsobem je barvení stříbrem. Toto
barvení je sice 10 - 100 x citlivější, ale jelikoţ se stříbrné ionty váţou jen na některé
aminokyselinové zbytky (Asp, Glu, His, Cys, Met, Lys), nelze tuto metodu povaţovat za
plně kvantitativní. Nejnovější metodou je fluorescenční barvení, které je kvantitativní
a také slučitelné s hmotnostní spektroskopií jako Coomassie a svou citlivostí je
srovnatelné s barvením stříbrem, ale nevýhodou je jeho vysoká cena. Nezachycené
barvivo se vymyje a výsledkem je tzv. Proteinová mapa.
Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek
Nedenaturující nebo téţ nativní elektroforéza je elektroforézou, která neprobíhá v
přítomnosti denaturačních činidel, jako např. Urey nebo SDS. Je technikou pouţívanou
pro určení velikosti a podjednotkového sloţení a optimálních separačních podmínek pro
daný protein. Tato elektroforéza je vysoce flexibilní umoţňující pracovat v celém rozsahu
pH.
Dvourozměrná gelová elektroforéza
Dvourozměrná gelová elektroforéza je kombinací dvou separačních technik,
izoelektrické fokusace a SDS-PAGE. V prvním gelu dochází k separaci proteinů podle
jejich isoelektrického bodu. Dále pak proteiny z prvního gelu migrují do druhého gelu,
kde jsou rozděleny pomocí SDS elektroforézy v závislosti na jejich velikosti.
Výsledné dvourozměrné gely obsahují mnoţství bodů dobře od sebe
rozpoznatelných. Při pouţití citlivé detekce, např. Barvení stříbrem nebo autoradiografie,
obsahují tyto gely aţ 1500 bodů. Pro srovnání – jednorozměrná separace umoţňuje
rozlišení pouhých 100 prouţků a kaţdý tento prouţek obsahuje několik proteinů. Proto je
dvourozměrná elektroforéza metodou s maximálním rozlišením. V případě
imunoprecipitátů nám tato metoda umoţňuje monitorovat změny v náboji nebo
molekulové hmotnosti cílových proteinů. Toto je velmi důleţité při studiu
rekombinantních proteinů, jejichţ vlastnosti mohou být pouze mírně odlišné od
přirozených intracelulárních proteinů.
Nevýhodou dvourozměrné elektroforézy je časová a manuální náročnost. Dalším
problémem je nedostatečné rozlišení v případě, ţe jsou si dva proteiny tak podobné, ţe se
zobrazí pouze jako jedna skvrna v gelu. Tento problém však můţe vyřešit pouţití úzkého
rozsahu pH při isoelektrické fokusaci, které zvýší rozlišení.
Posledním krokem minipreparativní SDS-PAGE je vyřezání části gelu s cílovým
proteinem a následná eluce. Sloţení elučního pufru úzce souvisí s typem SDS-PAGE,
která byla pouţita k separaci proteinů.
113
Izoelektrická fokusace (IEF)
Izoelektrická fokusace je další metoda, která se realizuje elektroforetickou
technikou a lze ji řadit mezi preparativní elektromigrační techniky. Zatímco elektroforéza
na nosičích se provádí za konstantního pH, k separaci při izoelektrické fokusaci dochází v
gradientu pH, který se ustaví mezi dvěma elektrodami. Separovaná látka se pohybuje
vlivem el. proudu v gradientu pH aţ do okamţiku, kdy se dostane do oblasti pH shodné
s jeho izoelektrickým bodem. Tam ztratí náboj, zastaví se a bude se v tomto bodě
koncentrovat. IEF je tedy rovnováţná technika a současně elektroforetická technika
s pravděpodobně nejvyšším stupněm rozlišení. Tímto způsobem je moţno od sebe oddělit
(a tak identifikovat) sloučeniny, jejichţ izoelektrické body se od sebe liší o 0,001 pH
jednotky.
Kapilární elektroforéza
Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv. Kapilární elektroforéza, která vyuţívá
elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř
křemenné kapiláry. Tomuto způsobu elektroforézy se říká vysokoúčinná kapilární
elektroforéza (HPCE) a provádí se několika způsoby – jako volná elektroforéza, gelová
elektroforéza, ale i jako izoelektrická fokusace.
Volná kapilární elektroforéza
Provádí se v otevřené kapiláře naplněné elektrolytem. K separaci dochází
kombinací vlivu elektroforetické migrace a elektroosmotického toku. Elektroforetickou
migrací rozumíme pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Elektroosmotický tok je
tok elektrolytu způsobený nábojem vnitřní stěny kapiláry a aplikovaným potenciálem. Ve
styku s elektrolytem mají silanové skupiny podél vnitřní stěny kapiláry tendenci
ionizovat a vytvářet tak na rozhraní stěny kapiláry a elektrolytu elektrickou dvojvrstvu.
Kdyţ se do systému zavede stejnosměrný proud, kationty v elektrolytu v blízkosti stěny
kapiláry se pohybují směrem ke katodě a strhávají elektrolyt s sebou. Tak se vytváří
elektroosmotický tok směrem ke katodě. Různě nabité molekuly v separovaném vzorku
se pohybují různými směry podle náboje, ale všechny jsou neseny ve směru katody díky
elektroosmóze. Kladně nabité molekuly dosáhnou katody jako první, neboť
elektroforetická migrace i elektroosmotický tok mají stejný směr. Jestliţe se za podmínek
volné kapilární elektroforézy separují anionty, pak elektroosmotický tok elektrolytu
a elektroforetická migrace mají opačný směr. Směr elektroosmotického toku však můţe
být změněn přidáním povrchově aktivních chemických aditiv do elektrolytu.
114
Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE
Nejjednodušší způsob stanovení molekulové hmotnosti purifikovaných proteinů
nebo peptidů je spojen s jednorozměrnou denaturační elektroforézou, provedenou na
gradientovém gelu. Nabarvením tohoto gelu Coomassie brilliant blue modří a srovnáním
velikosti sledovaného proteinu s pouţitým proteinovým standardem, který je komerčně
dostupný, určíme velikost sledovaného proteinu. Pro určení molekulové hmotnosti a
izoelektrického bodu se pouţívá dvourozměrná denaturační elektroforéza.
Pokud chceme sledovat změny molekulových hmotností v souvislosti s
posttranslačními modifikacemi (např. glykozylacemi), známe-li tedy hmotnost
sledovaného proteinu, zvolíme hustotu polyakrylamidového gelu tak, aby umoţňoval
maximální rozlišení v oblasti sledovaných molekulových hmotností (pod 40 kDa na 12%
gelech, 40–80 kDa na 10% gelech, 70–200 kDa na 8% gelech, nad 200 kDa na 6%
gelech). Pouţijeme vhodný proteinový marker a hmotnost proteinu odečítáme od tohoto
markeru. V současné době je dostupná celá řada proteinových markerů, která zahrnuje
markery vhodné pro různé způsoby detekce, mající různou škálu hmotnostních markerů.
Sledované proteiny můţeme detekovat buď barvením gelu bromfenolovou modří,
nebo immunodetekcí. Zvolený způsob detekce zvolíme v závislosti na mnoţství
sledovaného proteinu a typu experimentu, který provádíme.
Flow field flow frakcionace (FFFF)
Flow field flow frakcionace je velmi účinná metoda pro separaci makromolekul,
proteinů, koloidů a nanočástic s obrovským dynamickým rozsahem (tj. všechny tyto
analyty mohou být separovány společně v jednom separačním běhu a s vysokým
rozlišením). V kombinaci s MALS detektorem (rozptyl světla) poskytuje FFFF
spolehlivou a absolutní (tj. bez potřeby kalibrace pomocí standardních částic) velikostní
charakterizaci vzorku, čímţ nahrazuje mnohem draţší, pracnější a časově náročnější
techniky, jako je analytická ultracentrifugace, elektronová mikroskopie a AFM (atomic
force microscopy, mikroskopie atomárních sil).
Field flow frakcionace (FFF) je zaloţena na spolupůsobení laminárního toku
a transverzálního (kolmého) silového pole. Separace probíhá v kanálu tvořeném dvěma
plochými skleněnými, kovovými, nebo plastovými deskami oddělenými folií – spacerem.
Tento spacer udává výšku separačního prostoru, která se pohybuje mezi 80 aţ 500 μm.
Nejjednodušším a historicky prvním provedením FFF je gravitační FFF. Představme si,
ţe do separačního kanálu nastříkneme směs částic a (o průměru 10 μm) a b (o průměru
0.5 μm). Zatímco všechny částice a pro svoji větší hmotnost sedimentují aţ na dno
(akumulační stěnu) kanálu, menší částice b kromě sedimentace vykonávají i Brownův
pohyb, a tudíţ vytvoří rovnováţnou zónu o určité výšce nad akumulační stěnou kanálu.
K vlastní separaci pak dojde spuštěním průtoku a vytvořením parabolického profilu toku:
115
částice a jsou eluovány proudnicí, která je nejblíţe ke dnu, a je tudíţ nejpomalejší. Zóna
částic b zasahuje do vyšších, a tudíţ rychlejších proudnic, proto je eluována dříve.
Záměnou gravitačního pole za jiné transverzální silové pole (např. termální
gradient, elektrické pole, příčný tok) vznikla celá rodina FFF technik. Asymetrická flow
field flow frakcionace (AF4) vyuţívá síly příčného toku, který unáší vzorek k akumulační
stěně kanálu (Obr. 6.1). Zatímco horní stěna kanálu pro AF4 je nepropustná, akumulační
stěna je vyrobena z porézní frity, takţe je propustná a při vhodném tlaku uvnitř kanálu
umoţňuje příčný tok. Frita je pokryta ultrafiltrační membránou o velikosti pórů 10 kDa,
aby nedocházelo k úniku vzorku akumulační stěnou. Aby byl zajištěn konstantní tlak po
celé délce kanálu, profil kanálu se zuţuje. Jak uţ bylo zmíněno výše, menší analyty jsou
eluovány rychleji, protoţe vytvářejí rovnováţné Brownovské zóny v oblasti vyšších
(rychlejších) proudnic, takţe na výstupu z kanálu jsou analyty separovány podle
velikosti. Závislost elučního objemu na molekulové hmotnosti nebo velikosti částic je u
FFF opačná ve srovnání s gelovou permeační chromatografií (GPC), kde jsou větší
molekuly eluovány dříve neţ molekuly s menší velikostí (Obr. 6.2).
Obrázek 6.1: separační princip AF4
Kromě velkého dynamického rozsahu nabízí AF4 další velkou výhodu – uvnitř
kanálu není ţádné medium, které by mohlo se vzorkem nějak reagovat, takţe ani
v případě velkých polymerů se nemusíme obávat střiţných sil. Střiţné síly působí např. U
GPC, kdy se větší komplexy, např. Viry nebo nekovalentně vázané proteinové komplexy,
mohou rozpadat vlivem střiţných sil při penetraci porézní chromatografickou matricí.
Celá separace je velmi jemná, rychlá, není destruktivní a nehrozí zde interakce se
stacionární fází, která by mohla vést ke změně elučního chování (opět případ GPC, kdy
116
se některé proteiny mohou kvůli interakci s matricí eluovat anomálně), k degradaci nebo
ke změně vzorku.
Obrázek 6.2. AF4 kanály
AF4 má své nezastupitelné místo v molekulární biologii, v nanotechnologiích,
environmentálních analýzách, při separacích a charakterizacích proteinů a jejich
agregátů, při separaci liposomů, emulzí, virových částic, polysacharidů, nanočástic,
polymerních latexů, koloidů, huminových kyselin atd. ve spojení s moderními detektory
(UV-VIS, fluorescenční detektor, mikroviskozimetrický detektor, refraktometrický
detektor, MALS - multi-angle light stattering detektor) a případně GPC umoţňuje tento
systém jedinečnou separaci polydispersních vzorků s vysokým dynamickým rozsahem
velikostí částic a jejich fyzikálně-chemickou charakterizaci, zahrnující i absolutní
molekulovou hmotnost a případně tvar molekuly (např. Větvení polymerů).
117
Obrázek 6.3. Charakteristika solubilizovaných pšeničných gluteninů AF4 MALS
Červená - odezva MALS detektoru (rozptyl světla) při 90°; modrá - odezva
UV detektoru; černá - průběh velikosti molekulární hmotnosti ve frakcích.
Obr. 6.3 ukazuje vyuţití AF4 ve spojení s MALS detektorem pro identifikaci rozdílů
ve velikostní distribuci a konformaci nízkomolekulárních a vysokomolekulárních
podjednotek gluteninu z pšeničné mouky. Komerční usopořádání FFF je zobrazeno na
Obr. 6.4.
Obrázek 6.4. Přístroj Eclipsea FFF od firmy Wyatt
118
Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering)
Metoda DLS je známa také pod názvy „kvazielastický rozptyl světla“ (QELS 
quasi elastic light scattering) a „foton korelační spektroskopie“ (PCS  photon correlation
spectroscopy). Je vhodná zejména pro stanovení hydrodynamického poloměru nanočástic
a také jeho změn v důsledku různých interakcí nanočástic. Lze ji také pouţít
k charakterizaci vzorků s bimodální nebo oligomodální distribucí částic v roztoku.
Základem metody DLS je měření fluktuace intenzity rozptýleného světla z
laserového zdroje okolo její průměrné hodnoty. Tyto fluktuace souvisí s interferenčním
zeslabováním a zesilováním světla rozptýleného na nestacionárních částicích dispersní
fáze, podléhajících Brownovu pohybu.
Rozptyl světla
Rozptyl je obecný fyzikální proces, v němţ jsou některé druhy záření, jako je
světlo, zvuk nebo pohybující se částice, přinuceny se odchýlit od přímé trajektorie. Kdyţ
paprsek světla prochází koloidní dispersí částic, jeho paprsek se rozptyluje ve všech
směrech. V případě, ţe částice jsou velmi malé ve srovnání s vlnovou délkou světla, je
intenzita rozptýleného světla izotropní, tj. stejná ve všech směrech (Rayleighův rozptyl).
Pro větší částice (nad průměr přibliţně 250 nm) existuje úhlová závislost intenzity
rozptýleného světla (Mieho rozptyl). Tuto úhlovou závislost popisuje teorie, kterou
vytvořil Mie.
DLS vyuţívá Reyleighův rozptyl světla (Rayleigh scattering). V případě proteinů
se jedná o částice, které jsou výrazně menší (do 30 nm), neţ je pouţitá vlnová délka
světla laseru (obvykle he-ne laser s λ 633 nm). V případě, ţe velikost částice je daleko
menší neţ vlnová délka pouţitého světla d ≤ λ / 10, dochází k izotropickému rozptylu,
coţ znamená, ţe intenzita rozptýleného světla vertikálně polarizovaného laserového
paprsku je stejná ve všech směrech. Tím, ţe úhlové rozloţení intenzity rozptýleného
světla je konstantní, lze v případě proteinů částic provádět měření při jednom úhlu pro
stanovení jejich hmotnosti (jak uvidíme níţe). Obvykle se pouţívá snímání světla v úhlu
90° a nebo nověji při zpětném úhlu 173° (back scattering). Toto uspořádání umoţňuje
měření i koncentrovaných vzorků, neboť je potlačen vliv vícenásobného rozptylu světla.
Rayleighova aproximace udává, ţe intenzita rozptýleného světla je úměrná šesté
mocnině průměru částice a nepřímo úměrná čtvrté mocnině vlnové délky světla
pouţitého laseru.
Ι ≈ d6 ; ι ≈ 1 / λ4
119
Ι = intenzita rozptýleného světla; D = průměr částice; λ = vlnová délka světla laseru
Přítomnost velkých částic (např. Agregáty proteinů, fragmenty buněk, prach a
nečistoty) překrývá signál malých částic. Např. Intenzita rozptýleného světla na částicích
s průměrem 50 nm je milionkrát větší neţ intenzita světla rozptýlená na částicích s
průměrem 5 nm. Jinými slovy, intenzita rozptýleného světla jednou takovou částicí je
ekvivalentní intenzitě světla rozptýleného milionem částic s desetkrát menším
poloměrem. Inverzní vtah mezi intenzitou rozptýleného světla a vlnovou délkou laseru
nám napovídá, ţe pro měření malých částic v nízké koncentraci můţe být výhodné
pouţití laserů s kratší vlnovou délkou. Prakticky je však He-Ne laser 633 výkonem 10
mW dostačující pro většinu měření.
Brownův pohyb
Brownův pohyb je náhodný pohyb malých částic, který je způsobován nárazy
molekul rozpouštědla (voda, ionty solí). Čím větší je částice, tím menší je vliv nárazů
molekul rozpouštědla a tím pomalejší Brownův pohyb tato částice vykonává. Naproti
tomu na malé částice, které mají také menší hmotnost, má náraz molekul rozpouštědla
daleko silnější účinek a změna rychlosti a směru pohybu je výraznější. Technika DLS
měří Brownův pohyb částic a dává jej do vztahu s jejich hmotností. Velikost Brownova
pohybu je určena parametrem zvaným difuzní koeficient a je označována jako D (m2/s).
n = viskozita rozpouštědla (voda = 8,94 x 10-4 kg/ms); T = teplota (°K); D = difuzní
koeficient (m2/s); kB = boltzmannova konstanta (1,3807 x 10-23 J/K); d = průměr koule
(m).
Z rovnice je patrné, ţe difuzní koeficient D pro danou částici je nepřímo úměrný
jejímu průměru a je závislý na teplotě (kinetická energie částic rozpouštědla) a viskozitě
(odpor kladený pohybu částice v rozpouštědle). Je tedy jasné, ţe pro měření pomocí DLS
je nezbytná přesná znalost teploty a viskozity rozpouštědla. Je vhodné připomenout, ţe
hodnota viskozity je závislá na teplotě. Jakýkoliv ne-Brownovský pohyb (např.
Sedimentace částic, konvexní proudění kapaliny vlivem nehomogenity teploty v cele,
120
koncentrační nehomogenita vzorku) vnáší velikou chybu do stanovení d, a tím i
hydrodynamického poloměru částic Rh.
Na základě Stokes-Eeinsteinovy rovnice můţeme vyjádřit hydrodynamický poloměr
částice Rh jako:
R(h) = kt / 3πεd
Pro proteiny pak můţeme vypočítat molekulovou hmotnost na základě znalosti R(h) ze
vztahu:
mw = (d x α)β
d = průměr koule v nm
α = korekční faktor = 1,68
korekční faktor = 2,3398
hmotnost v kDa
Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh)
Skutečný tvar molekuly většiny proteinů se liší od kulového tvaru (např. Elipsoid,
tyčka, disk). Hydrodynamický poloměr je tedy aproximací skutečného tvaru proteinu na
tvar koule o takovém poloměru, pro který by tato koule vykazovala stejný difuzní
koeficient d jako daný protein.
Obrázek 6.5. Srovnání pohybu malé a velké částice vlivem Brownova pohybu
121
Princip metody DLS
Pouţijeme-li koherentní a monochromatický paprsek laseru, je moţné s pomocí
vhodného detektoru, jako např. Fotonásobiče, stanovit v krátkých časových intervalech
mnoţství rozptýlených fotonů, a tak přesně měřit intenzitu světla rozptýleného částicemi
ve vzorku. Vzhledem k Brownovu pohybu částic fluktuuje hodnota intenzity
rozptýleného světla kolem střední hodnoty, dané velikostí a koncentrací částic ve vzorku.
Fluktuace intenzity rozptýleného světla jsou způsobeny Brownovým pohybem částic,
který způsobuje, ţe vzdálenost mezi částicemi se neustále mění, coţ ovlivňuje
konstruktivní a destruktivní interferenci světelných vln emitovaných sousedními
částicemi rozptýlenými v osvětlené oblasti vzorku. Kolísání intenzity rozptýleného
světla, které je zaznamenáno detektorem, obsahuje informaci o pohybu částic, tedy o
jejich difuzním koeficientu, a tedy o jejich hydrodynamickém poloměru.
Obrázek 6.6. Fluktuace signálu intenzity rozptýleného světla
122
Časová závislost intenzity fluktuace je nejčastěji analyzována pomocí digitálního
korelátoru, který provádí srovnání okamţité hodnoty intenzity světla v čase t a srovnává
ji s hodnotou naměřenou v čase t + δt; t + 2δt; t + 3δt; t + nδt. Řešením vztahu závislosti
změny intenzity rozptýleného světla na čase je autokorelační funkce, která má tvar
exponenciálního poklesu korelačního koeficientu. Čím větší je pohyb částic, tím rychleji
klesá korelační koeficient. Analýza autokorelační funkce vede k získání translačního
difuzního koeficientu d a výpočtu hydrodynamického poloměru R(h).
Autokorelační funkce
g   
I t I t   
I t 
q  
 A   Be 2 q D
2
2
4n

sin

2
I = intenzita rozptýleného světla v čase t
Konstanty přístroje:
A = základní hladina
B = faktor související s optikou přístroje
q = vektor rozptylu
D = translační difuzní koeficient
τ = časová změna, n = index lomu vzorku
λ = vlnová délka světla laseru, α = úhel rozptylu
Získání informace o velikosti částic z autokorelační funkce
123
Pro tento účel byla vyvinuta řada algoritmů, které lze rozdělit do dvou skupin.
První skupinu tvoří algoritmy, které autokorelační funkci vyjádří jako jednoduchou
exponenciální funkci a výsledkem je průměrná velikost označovaná jako δ-průměr (zetaaverage diameter) a šíře distribuce velikosti, která je označována jako index
polydispersity (PDI, polydispersity index). Druhý přístup je zaloţen na vyjádření
autokorelační funkce multiexponenciální funkcí, která umoţní charakterizovat distribuci
velikosti částic v heterogenních vzorcích s bimodální nebo polymodální distribucí
velikosti částic. Nejčastěji se setkáme s algoritmy označovanými zkratkou NNLS (nonnegative least squares) nebo CONTIN. Pro monodispersní systémy má autokorelační
funkce jednoduchý tvar, zobrazený na Obr. 6.7.
Obrázek 6.7a. Průběh jednoduché autokorelační funkce pro standardní 96 nm
polystyrenové částice
Obrázek 6.7b. Srovnání tvaru autokorelační funkce (rychlost poklesu korelačního
koeficientu) pro malé částice (ovalbumin) a velké částice (nanočástice oxidu
křemičitého)
124
V případě polydispersních vzorků je tvar autokorelační funkce vlivem příspěvků
od různě velikých částic podstatně komplikovanější, ale rovněţ řešitelný. Tvar
autokorelační funkce pro bimodální distribuci je Obr. 6.8.
Obrázek 6.8. Tvar korelační křivky pro bimodální distribuci
125
Analýza autokorelační křivky v monomodálním modu poskytne kumulativní
velikost 12,4 nm (z-average diameter), zatímco pouţití analýzy multimodální distribuce
ukazuje na existenci částic o velikosti 3,5 nm a 388 nm.
Vyjádření výsledků distribuce velikosti
Distribuci velikosti částic lze vyjádřit jako 1) distribuci podle intenzity
rozptýleného světla; 2) distribuci podle objemu částic; 3) distribuci podle počtu částic.
1.
Distribuce velikosti je vynesení relativní intenzity světla rozptýleného částicemi
v určité velikostní škále (třídě). Toto vynesení je nazýváno distribuce podle intenzity. Pro
monodispersní vzorky s nízkou polydispersitou není třeba převádět distribuci podle
intenzity na distribuci podle objemu částic. V případě polydispersního vzorku nebo
vzorku s multimodálním rozdělením velikosti je nezbytné provést převedení výsledků na
distribuce podle objemu částic, které dává daleko realističtější pohled na takový vzorek.
Ze vztahu velikosti částice a intenzity rozptýleného světla (viz odstavec rozptyl světla)
vyplývá, ţe veliké částice v důsledku větší intenzity rozptylu světla silně nadhodnocují
svůj příspěvek k celkové distribuci, která je vyjádřena jako distribuce podle intenzity.
2.
Příspěvek částic z hlediska jejich objemu je vyjádřen distribucí podle objemu
částic. Prakticky to znamená, ţe příspěvek jedné velké částice je zhruba ekvivalentní
příspěvku tisíce částic s desetkrát menším průměrem.
3.
Distribuce podle počtu částic pak charakterizuje systém z hlediska počtu částic
v jednotlivých velikostních třídách.
Obecně lze říci, ţe příspěvek větších částic je zvýrazněn v následujícím pořadí
vynesení distribuce d: d (intenzita) > d (objem) > d (počet).
Názorně pochopíme příspěvek jednotlivých vynesení z Obr. 6.9, kde je ukázán
vliv velikosti částic na jednotlivá vynesení podle intenzity, objemu a počtu částic. Pokud
analyzujeme vzorek připravený ze stejného počtu částic s průměrem 5 a 50 nm, pak
vynesení podle počtu částic ukazuje poměr 1 : 1. Pokud převedeme data na distribuci
podle objemu, pak poměr malých a velkých částic bude v poměru 1 : 1 000 (objem
kulovitých částic je roven to 4 / 3π(d / 2)3, a tedy je v poměru třetích mocnin průměru).
Další konverze dat na vyjádření podle intenzity pak dává poměr 1 : 1 000 000 (intenzita
rozptylu světla je podle rayleighovy aproximace úměrná šesté mocnině průměru částice).
126
Obrázek 6.9. Srovnání vyjádření distribuce částic podle množství, objemu a
intenzity pro vzorek 5 a 50 nm částic smíchaných v poměru 1 : 1
Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic
V případě velmi malých částic, jako jsou proteiny, má na jejich difuzní koeficient
vliv několik faktorů. Mezi hlavní můţeme zařadit změnu tvaru vlivem pH, iontové síly
prostředí, teploty a interakce s dalšími molekulami (např. Dimerizace, interakce
s lidgandy, deglykozylace ap.). Ionty v mediu a jejich koncentrace mohou ovlivnit
difuzní koeficient ovlivněním tloušťky elektrické dvojvrstvy (debyeova dvojvrstva) a tím
i δ-potenciálu. Tato dvojvrstva je větší v mediu s niţší vodivostí. Také povrchové
struktury nanočástic jsou ovlivněny vlastnostmi media a tyto struktury mohou výrazně
měnit jak tvar, tak difuzní koeficient částic. Zejména jsou tyto efekty silné u částic
s povrchem modifikovaným polymery (v případě proteinů se jedná o glykoproteiny nebo
proteiny modifikované syntetickými polymery jako polyethylen glykol, které zvyšují
jejich stabilitu v séru).
Díky své citlivosti je DLS je velmi vhodnou metodou pro sledování těchto
jemných změn makromolekul a nanočástic v jejich přirozeném vodném prostředí.
Přístroje pro měření pomocí DLS
Existuje celá řada renomovaných firem, které nabízejí přístroje pro DLS. Jsou to
např. Malvern, Nicomb, Coulter, Wyatt, Horiba, Brookhaeven. Zde se zmíníme o
principu přístroje Nanosizer ZS od firmy Malvern, který patří k absolutní špičce.
Tento přístroj se vyznačuje měřením signálu rozptýleného světla při zpětném úhlu
173° (backscattering angle). Toto uspořádání umoţňuje měření velmi hustých vzorků (aţ
40%), neboť eliminuje vliv vícenásobného rozptylu, který nastává při vysoké koncentraci
127
částic v roztoku. Tento přístroj také umoţňuje měření δ-potenciálu nanočástic, lze měřit
v teplotním rozsahu 290°C, a tak studovat např. denaturační křivky proteinů, DNA
a teplotně závislé strukturální změny nanočástic. Unikátní je také rozsah měření
v rozmezí 0,6 nm aţ 6 µm. Tato citlivost je co do velikosti a koncentrace jedinečná a
důleţitá pro studium proteinů, jejichţ velikost se pohybuje v jednotkách aţ desítkách
nanometrů, a koncentrace lze pouţít jiţ v desítkách mikrogramů proteinu na mililitr.
Zejména u vzácných vzorků je významná moţnost pouţití mikrocely s objemem 12 µl.
Obrázek 6.10. Optické uspořádání přístroje Nanosizer ZS
Některé aplikace DLS při studiu proteinů:
-
-
Stanovení hydrodynamického poloměru Rh.
Stanovení absolutní molekulové hmotnosti a interakce s rozpouštědlem (optimalizace
podmínek pro krystalizaci proteinů).
Studium čistoty preparátů a agregace proteinů.
Studium teplotní stability proteinů a proteinových preparátů.
Studium interakce proteinů (dimerizace, oligomerizace, interakce s ligandy, štěpení a
degradace proteinů – např. Účinek proteáz, glykozyláz, kináz, štěpení disulfidových
S-S vazeb).
Vazba proteinů na nanočástice – liposomy.
Solubilizace membránových proteinů a jejich rekonstituce do lipidních membrán.
Studium změny konformace proteinu na základě změny Rh a stanovení tvaru proteinu
na základě vztahu mezi Rh a Rg.
128
Pohyblivá zaostřovací čočka umoţňuje snímání signálů z různé hloubky kyvety, a
tak eliminuje u koncentrovaných vzorků vícenásobný rozptyl (viz Obr. 6.10b).
Výhody a omezení DLS
Výhody DLS:
-
Měření nativního stavu biopolymerů a nanočástic ve vodném prostředí, stanovení
jejich Rh, δ potenciálu, molekulové hmotnosti.
-
Nedestruktivní a rychlá metoda.
-
Cenová dostupnost (přístroje v cenové relaci kolem 1,5–2 milionů korun).
-
Malá spotřeba vzorku (12 µl komůrka, koncentrace v desítkách aţ stovkách µg/ml).
-
Studium vlivu prostředí a interakcí na biopolymery a nanočástice.
-
Velký rozsah velikosti (přes tři řády) částic (od 0,6 nm do 6 µm).
-
Moţnost spojení se separačními technikami (GPC, FFF)
-
Stanovení malého mnoţství agregátů s vyuţitím distribuce podle intenzity.
Omezení DLS:
Obtíţná analýza polydispersních vzorků.
-
Překrývání signálu malých částic signálem z velkých částic.
-
Obtíţná analýza sedimentujících nebo velmi viskózních vzorků.
Vyuţití statického rozptylu světla pro měření absolutní molekulové hmotnosti
proteinů na přístroji Nanosizer ZS.
Vztah mezi molekulovou hmotností a intenzitou rozptýleného světla popisuje
Zimmova rovnice, která platí pro částice pod 200 nm, kde výraz určuje úhlovou závislost
intenzity rozptýleného světla.
129
K = optická konstanta přístroje
Rζ = Rayleighův poměr intenzit rozptýleného světla a intenzitou paprsku laseru
c = koncentrace proteinu
A = viriální koeficient n-tého řádu
Rg = poloměr gyrace
M = molekulová hmotnost proteinu
λo = vlnová délka pouţitého laseru
no = refraktivní index rozpouštědla
P (ζ) = úhlová závislost intenzity rozptýleného světla
ζ = úhel měření rozptýleného světla
Pro částice s gyračním poloměrem Rg ≤ 15 nm (coţ splňují proteiny) je hodnota 1
/ P (ζ) rovna přibliţně 1a. Zimmovu rovnici lze zjednodušit na tvar:
Kc / Rζ = (1 / M + 2A2c)
Grafickým vynesením Kc / Rθ proti koncentraci proteinu c získáme hodnotu
molekulové hmotnosti M a také směrnici A2, která je hodnotou druhého viriálního
koeficientu a udává sílu interakce mezi povrchem částice a daným rozpouštědlem.
Pro A2 > 0 platí, ţe částice má tendenci zůstat v roztoku.
Pro A2 = 0 jsou interakční síly vyrovnány a solvent je charakterizován jako theta solvent.
Pro A2 < 0 platí, ţe částice má tendenci agregovat.
Určení druhého viriálního koeficientu je vhodné pro nalezení správných
podmínek pro krystalizaci proteinu a přípravu pro jeho studii struktury pomocí
rentgenové difrakce.
Obrázek 6.11. Graf pro určení molekulové hmotnosti proteinu a druhého viriálního
koeficientu
130
Ukázka praktické aplikace
Rekombinantní protein OspC byl navázán na povrch liposomů metalochelatační
vazbou (Obr. 6.12). Z elektronového transmisního mikroskopu ukazuje strukturu
liposomů a šipky označují molekuly proteinu vázané na povrchu liposomu. Identita
proteinu byla prokázána imunoznačením částicemi koloidního zlata s navázanými
specifickými protilátkami proti OspC (černé šipky označují 10 nm částice koloidního
zlata). Preciznost přístroje Nanosizer ZS (Malvern) umoţňuje rozlišit i malé změny
velikosti liposomů, způsobené navázáním proteinů s relativně malou molekulovou
hmotností na jejich povrch (Obr. 6.13).
Obrázek 6.12. Elektron mikroskopický průkaz vazby OspC na liposomy
131
Obrázek 6.13. Distribuce velikosti a hydrodynamický poloměr rekombinantního
proteinu OspC, liposomů a liposomů s povrchově vázaným OspC
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC)
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) je nenahraditelná metoda pro studium
stability biologických systémů.
Stabilita biologických makromolekul a jejich vyšších seskupení je kvantifikována
standardní volnou energií, ΔG°, coţ je rozdíl v Gibbsově energii mezi různými stavy
(např. nativní a denaturovanou strukturou v případě proteinů a nukleových kyselin).
V rovnováze (kdyţ ΔG = 0) platí pro vztah ΔG° a rovnováţné konstanty (K) mezi těmito
dvěma stavy následující rovnice:
ΔG° (T) = ‒RT lnK(T),
kde R je univerzální plynová konstanta a T je absolutní teplota v kelvinech. ΔG° je
součtem dvou příspěvků, entalpického a entropického:
ΔG° (T) = ΔH° (T) ‒ T ΔS° (T),
kde ΔH° (T) a ΔS° (T) jsou změny entalpie a entropie při teplotě, při které
vyhodnocujeme ΔG°.
Kdyţ makromolekula změní svůj termodynamický stav (např. rozvine svoji
sekundární strukturu), změní i svoji tepelnou kapacitu Δcp. Teplo vyţadované pro ohřev
132
roztoku rozvinutého proteinu je o 1 °C vyšší neţ v případě roztoku svinutého proteinu (s
nativní sekundární strukturou). K těmto změnám tepelné kapacity dochází především
v důsledku přeskupení molekul rozpouštědla kolem nepolárních vedlejších řetězců, které
byly v rámci nativní sekundární struktury orientovány dovnitř biomolekuly a v důsledku
„rozbalení“ sekundární struktury jsou nyní vystaveny do volného roztoku a solvatovány.
„Rozbalení“  obecně tranzice  nastává při charakteristické teplotě nazvané teplota
tání (transition midpoint, Tm). Je to teplota, při které se protein vyskytuje z 50 %
v nativním a z 50 % v rozbaleném stavu. Čím stabilnější je biopolymer, tím vyšší je Tm.
Charakterizovat termodynamiku tranzice znamená určit ΔG°, ΔH° a ΔS° při dané
teplotě a získat Δcp, abychom určili, jak se mění tyto tři parametry s teplotou.
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) je technika pro studium termálně
indukované tranzice a zejména konformační tranzice biologických makromolekul (např.
rozvinutí sekundární struktury proteinu nebo rozvolnění dvoušroubovice DNA). DSC
měří mnoţství tepla absorbovaného nebo uvolněného roztokem molekuly (cp) jako funkci
teploty. Tranzice se projeví ostrým endotermním píkem s maximem cp při teplotě tání
(Tm). Integrací kalorimetrické křivky (cp oproti teplotě) získáme tranziční entalpii ΔH° a
posun baseliny udává Δcp (Obr. 6.14). DSC je jediná metoda, kterou lze přímo získat
tranziční entalpií.
Hodnota ΔH°, vypočítaná z plochy pod tranzičním píkem, koreluje s obsahem
uspořádané struktury, kterou měl protein před tranzicí. Hodnota ΔH° je vlastně
kombinací endotermních příspěvků, jako je rozštěpení vodíkových můstků, a
exotermních příspěvků, jako je zrušení hydrofobních interakcí. Šířka píku podává
informaci o tom, jestli tranzice proběhla jako „two-state“ proces (tj. přímo z nativního do
denaturovaného stavu), nebo jako „multi-state“ proces, tedy přes jeden nebo více
intermediátů. Pokud tranzice proběhne v úzkém teplotním rozmezí, je hodnocena jako
vysoce kooperativní, tj. bez jakýchkoliv tranzičních intermediátů.
Obrázek 6.14. DSC experiment pro „two-state“ rozvinutí globulárního proteinu
133
DSC poskytuje vhled do mechanismu rozbalování a svinování biomolekul a dává
informace o reverzibilitě termálních procesů. Umoţňuje měření v roztocích, které nejsou
vhodné pro optické metody, jako např. Zakalené nebo barevné roztoky nebo suspenze
částic. Poskytuje informaci o konformační energetice proteinů a biopolymerů.
Můţe objasnit faktory, které přispívají k udrţení konformace a stability nativních
biomolekul, coţ zahrnuje hydrofobní interakce, vodíkové můstky, konformační entropii
a fyzikální prostředí.
Obrázek 6.15. Termální tranzice α-amylasy sledovaná pomocí DSC
134
AHA: psychrofilní α-amylasa z P. haloplanktis; PPA: prasečí pankreatická αamylasa; BBA: α-amylasa z Bacillus amyloliquefaciens. Tvar tranziční křivky PPA a
BAA naznačuje, ţe tyto tranzice neprobíhají jako „two-state“, ale přes tranziční
intermediáty. Dekonvoluce prozrazuje dvě kalorimetrické domény v případě ppa a tři
domény v případě BAA.
135
7. HORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE
Historie
V roce 1867 upozornil švýcarský botanik s. Schwendener na podvojnou povahu
lišejníků a uvaţoval o evolučním významu koexistence dvou rozdílných organismů
v jednom. Tuto myšlenku rozpracoval německý biolog a. De bary roku 1879. Pro různě
odstupňované vztahy mezi organismy (od relativně volného souţití primitivní
protokooperace nebo komenzalismu, při nichţ mají obě strany určitý prospěch, aţ po
kompetici, parazitismus a predaci, kdy si vzájemně škodí) zavedl pojem symbióza. Roku
1893 vyslovuje myšlenku o symbiotickém původu buněčného jádra americký embryolog
a cytolog S. Watase a o jedenáct let později také německý cytolog T. Boveri. Ruský
biolog K. S. Mereţkovskij na základě svých detailních studií chloroplastů v rostlinných
buňkách zavádí termín symbiogeneze (1905, 1909), který později (1920) podrobně
rozvíjí do teorie symbiogeneze. V téţe době razí podobnou hypotézu ještě ruský anatom
a. S. Famintsyn a americký biolog I. E. Wallin. Famintsyn prokázal, ţe chloroplasty mají
symbiotický původ, zachovávají si svoje fotosyntetické funkce, i kdyţ jsou kultivovány
mimo rostlinnou buňku. Oběma vědcům se podařilo nalézt řadu shodností mezi funkčním
projevem bakterií a chloroplastů, z čehoţ vyvodili, ţe chloroplasty byly původně
fotosyntetizující mikroby, které byly fagocytovány, ale nebyly stráveny a uvnitř fagocytů
dále vykonávaly fotosyntézu. Zachovaly si také schopnost nezávislého rozmnoţování. V
roce 1918 francouzský biolog P. Portier razil teorii, ţe mitochondrie jsou rovněţ
endosymbiotické bakterie, coţ vyvolalo naprosté odmítnutí.
V roce 1927 rozpracoval wallin stejnou myšlenku. O rok později F. Griffith
provedl své známé transformační pokusy s různými mutanty pneumokoka (streptococcus
pneumoniae), které se odlišovaly některými vlastnostmi, a tudíţ, ţe dědičnost lze cíleně
měnit. V roce 1944 prokázali američtí badatelé o. T. Avery, C. M. Macleod a M.
Mccarty, ţe za tuto navozenou dědičnou změnu (transformaci) je odpovědná DNA a
nikoliv bílkoviny, jak byla tehdy většina vědců přesvědčena. Byl to přímý důkaz, ţe geny
lze přenést i horizontálně, nejen vertikálně, tj. z rodičů na potomstvo. Rok 1944 lze bez
nadsázky povaţovat za datum zrodu molekulární genetiky. V šedesátých a sedmdesátých
letech 20. Století mluví L. Margulisová o horizontálním mezidruhovém přenosu
genetické informace jako o obecném biologickém fenoménu, který byl vlastní příčinou
vzniku eukaryotické buňky (teorie o symbiotickém původu jaderné buňky). Na její práce
navázal v roce 1970 n. G. Anderson (1970) a zdůrazňoval, ţe horizontální přenos genů
přes druhové bariéry má závaţné evoluční důsledky v daleko širším kontextu. V roce
1977 přinášejí c. R. Woese a g. E. Fox důkaz: nukleové kyseliny mitochondrií a
chloroplastů jsou příbuznější bakteriální nukleové kyselině neţ eukaryotické.
136
Výměna genetické informace
Bakteriální i eukaryotické buňky nejenţe geny přijímají a vestavují, ale i naopak,
nukleové kyseliny vylučují nebo se do prostředí dostávají z mrtvých buněk. Celé
molekuly nukleových kyselin, oligo- a mononukleotidy se ve vysokých koncentracích
vyskytují hlavně ve vodním prostředí. Fragmenty DNA mohou přetrvávat
v rozkládajících se tělech zvířat nebo v exkrementech týdny a v rostlinných zbytcích celá
léta. V teplotách nevystupujících nad bod mrazu, např. Ve věčně zmrzlé půdě, se volná
DNA uchovává po stovky let. Nukleové kyseliny jsou jako součásti buněk v trávicím
ústrojí ţivočichů štěpeny příslušnými enzymy a přijímány jako sloţky nutrice. Přes
buňky zaţívacího ústrojí pak přecházejí do krevního a mízního oběhu a jsou roznášeny
po těle, kde jsou vyuţívány pro růst a regeneraci tkání.
Horizontální přenos genetické informace přes druhové bariéry je zprostředkován
buď splýváním celých genomů dvou či více organismů, nebo vkládáním rozsáhlejších
genomových oblastí (např. Ostrovy patogenity u bakterií), nebo jen jednotlivých genů či
jejich částí (nukleotidy). V tomto případě jsou vektorem viry (fágy) a konjugační
plazmidy. např. geny pro fotosyntézu mořských bakterií byly vneseny fágy. Fágy jsou na
zemi nejpočetnější. Odhaduje se, ţe existuje 1030 fágových partikulí, které kaţdou vteřinu
infikují 1025 bakteriálních buněk. Mezi mobilní genetické elementy patří také
transpozony a retrotranspozony.
Dnes je naprosto prokázáno, ţe všechny jednobuněčné i mnohobuněčné
organismy mající v buňkách jádro (eukaryota), vlastní přinejmenším dva vzájemně těsně
spolupracující genomy: jeden představuje jaderná DNA a druhý je DNA obsaţená v
mitochondriích. Zatímco jaderný genom se dědí po obou rodičích, mitochondriální geny
jsou předávány potomstvu pouze po mateřské linii. Rostliny a řasy mají ještě třetí genom
v chloroplastech, coţ jsou původně fagocytované fotosyntetické bakterie. Pět i více
genomů mají jednobuněčné eukaryontní organismy ‒ prvoci, hlenky a láčkovci.
Bakterie
Bakterie rozstřihávají, přestavují a spojují geny, genové kazety i celé genomy uţ
po miliardy let. Horizontálním přenosem genů reorganizují své genomy, coţ jim
umoţňuje rychle získat nové vlastnosti (patogenitu a virulenci) a nové metabolické
reakce. Mezi nepříbuznými bakteriemi byly zjištěny homologické geny, zaujímající aţ 25
% jejich genomu, které se tam dostaly z jiných bakterií horizontálním přenosem. Stále se
rozšiřující rezistence na antibiotika je příkladem této genetické výměny. Z člověka
léčeného antibiotiky se rezistentní bakterie dostávají do vnějšího prostředí, kde předávají
geny rezistence dalším bakteriím. Rychlost tohoto přenosu lze odvodit nepřímo ze
statistik uveřejněných v USA: koncem 90. Let mělo 80 % lidí ve svém trávicím traktu
bakterie rezistentní na tetracyclin, zatímco před rokem 1970 to bylo jen 30 %. Byly
dokonce izolovány bakterie, které byly rezistentní na 31 druhů antibiotik. Biochemici na
137
arizonské univerzitě v tusconu odhadují, ţe podíl genetického materiálu přejatého od
jiných bakterií dosahuje aţ 90 % (Tab. 7.1).
Genetická informace se mezi bakteriemi přenáší buď volnou DNA, tzv.
Transformací nebo transdukcí, jak se označuje přenos části bakteriální DNA pomocí
bakteriálních virů (fágů), anebo konjugací, speciálním parasexuálním procesem, při
kterém se musí dvě bakterie dostat do fyzického kontaktu. Cizorodá DNA se
do bakteriálního genomu včleňuje několika způsoby: rekombinací, jde-li o DNA blízce
příbuzných druhů bakterií, nebo integrací, kdyţ se jedná o DNA fágů. Jiným způsobem
se připojuje DNA mobilních genetických elementů jako plazmidů, integronů anebo
transpozonů (geny přeskakující na různá místa chromozomu), který uskutečňují enzymy
transpozasy. Přenesená DNA můţe být rovněţ „nezákonitě“ vyuţita při opravě zlomů
dvoušroubovice DNA anebo můţe uvnitř bakteriální buňky dočasně přetrvávat ve formě
epizomu.
Eukaryota
Bakterie vnášejí své geny také do buněk eukaryotických organismů, hub, rostlin i
ţivočichů. Vznik eukaryotické buňky byl důsledkem horizontální výměny genetické
informace, v tomto smyslu výsledkem různých typů symbiotických souţití eubakterií i
archebakterií. Nitro eukaryotické buňky se stalo vhodným prostředím i pro viry, které
přenos genetické informace a tím i vznik evolučních novinek ještě víc urychlily.
Vybaveny schopností fagocytovat dostaly eukaryotické buňky do vínku hned tři evoluční
inovace: moţnost získávat větší kvanta potravy, neţ zabezpečovala pouhá difuze
rozpuštěných ţivin, moţnost likvidovat potenciální parazity a patogenní nepřátele, a co
bylo patrně evolučně nejvýznamnější, moţnost horizontální výměny genetické informace,
kdy uţ nebyly jejími vektory jenom viry nebo části genetického materiálu (transpozony,
retrotranspozony), ale endosymbioticky byly integrovány celé pohlcené organismy,
z nichţ se pak adaptivně vyvinuly buněčné organely. Příklady přenosů pro geny
regulující některé metabolické reakce jsou uvedeny v Tab. 7.2.
Tabulka 7.1. Potenciální dárci genetické informace do genomů některých zástupců
bakterií
bakterie
rozsah
genomu Mb
Bacillus subtilis
4,21
Borrelia burgdorferi
0,91
počet
atypických
oblastí
51
7
138
Taxon
eubakterie
G+ bakterie
Viry
eukaryota
% zastoupení
dárců z taxonu
69
50
16
50
Campylobacter
jejunii
Chlamydia
pneumoniae
Chlamydia
trachomatis
Escherichia coli
1,64
12
1,23
13
1,04
11
4,64
84
Haemophilus
influenzae
Helicobacter pylori
1,83
13
1,67
18
Mycobacterium
tuberculosis
Rickettsia prowazekii
4,41
43
1,11
10
eubakterie
viry
eubakterie
eukaryota
eubakterie
eukaryota
eubakterie
viry
eubakterie
enterobakterie
viry
eubakterie
eukaryota
eubakterie
G+ bakterie
eubakterie
γ-proteobakterie
eubakterie
eukaryota
25
25
50
38
58
25
58
25
87
56
10
59
35
83
33
95
50
59
30
Tab. 2: příklady horizontálního přenosu kompletních chromozomálních genových
sekvencí kódujících metabolické aktivity u eukaryot
Geny pro
Vektory
Původ
Glukozofosfátovou
Isomerasu
Fe superoxidovou
Dismutasu
Aldolasu
Cytochrom c
Escherichia coli
Dvouděloţné rostliny
Clarkia unguiculata (lokanka lepá)
Prokaryota
Xylanasu
Thioredoxin
Glyceraldehydovou
Dehydrogenasu
Entamoeba histolytica
Kvasinky
Arabidopsis thaliana
(huseníček thalův)
Rumonococcus
Rostliny
Escherichia coli
Anabaena (sinice)
Escherichia coli
Houby
Houby
Prokaryota
Eukaryota
Nejznámější bakterií, která přenáší své geny do rostlin, je Agrobacterium. Patří do
významného řádu, jehoţ zástupci vytvářejí ve spolupráci s rostlinnými pletivy hlízky
(rhizobia), symbiotická společenství mikrobů na kořenech rostlin. Agrobacterium však
vyvolává rostlinné nádory, protoţe je přenašečem plazmidu, jehoţ geny mění syntézu
růstových hormonů v buňkách rostlinných pletiv. Mechanismus plazmidového přenosu
139
u agrobakterií objevila v sedmdesátých letech minulého století m. D. Chiltonová na
Seattle university. Stala se zakladatelkou zcela nového vědního oboru  biotechnologie
rostlin. Jejím dalším významným úspěchem bylo, ţe se jí podařilo z agrobakterií odstranit
nádorotvorné geny, ale schopnost přenášet genetickou informaci zůstala zachována. To
otevřelo cestu k jejich praktickému vyuţití jako vektorů genetické informace. Jejich
prostřednictvím lze konstruovat nové, tzv. Geneticky modifikované odrůdy rostlin
nesoucí poţadované uţitné vlastnosti.
V rhizobiální symbióze ţije řada dalších půdních aerobních i anaerobních
bakterií, které přednostně váţí dusík z ovzduší a syntetizují dusíkaté látky důleţité pro
výţivu rostlin. Odhaduje se, ţe ročně pohltí na 90 milionů tun atmosférického dusíku, coţ
je srovnatelné s mnoţstvím dusíku pohlceným oceány, lesními porosty a ostatními
biotopy země dohromady. Tato fixační schopnost zemědělských půd závisí na vysoce
specializovaných symbiotických bakteriích rhizobium, frankia a azospirillum, které
přenášejí do rostlinných buněk plazmid vybavený genovou sekvencí řídící fixaci dusíku.
Na tomto prastarém, horizontálně získaném mechanismu bakteriální přeměny
atmosférického dusíku je lidstvo závislé nejméně od doby neolitu, kdy se začalo zabývat
pěstováním rostlin a zemědělské plodiny se staly převaţujícím zdrojem potravin.
Vznik imunity jako obrany integrity
V eukaryontním ţivém světě se muselo objevit něco, co zabezpečilo obranu
integrity, a tím neopakovatelnou jedinečnost kaţdé eukaryontní buňky, kaţdého
mnohobuněčného eukaryontního jedince. Bez schopnosti udrţet si vlastní jedinečnost by
nemohlo ani dojít k diverzifikaci druhů na zemi. Tato schopnost obrany integrity se u
ţivočichů označuje obecně jako imunita (v rostlinném světě pak jako rezistence). V 90.
letech minulého století byl získán nezvratný důkaz, ţe tzv. Adaptivní imunita vznikla u
čelistnatců na základě horizontálního přenosu genů. Adaptivní imunitní strategie je
zaloţena na vyuţití molekul imunoglobulinové nadrodiny: patří sem protilátky,
membránové receptory t a b lymfocytů a další efektorové molekuly. Předpokládá se, ţe
do genomu jejich předchůdců byly horizontálně vneseny transpozony bakterií, mobilní
genové sekvence Rag-1 a Rag-2 (z Angl. Recombination activation genes), kódující
přeskupování genových segmentů pro vazebné místo pro antigen na molekule
imunoglobulinů, čímţ bylo zajištěno generování nezměrné rozpoznávací variability.
Počet vazebných míst můţe dosahovat aţ 1018, coţ zajišťuje specifickou odpověď i na
struktury, které se v přírodě nevyskytují. Na horizontální přenos rag sekvencí ukazuje
řada podobností s jinými transpozony: transesterifikace DNA u nich probíhá podobně,
rovněţ se integrují jako viry hiv a jejich integrasy štěpí DNA podobně jako integrasy
HIV (Tab. 7.3).
140
Tabulka 7.3. Podobnost rag a některých transpozonů
Integrasa HIV
Rostlinné transpozony Ac Ds, Tam3
Transpozon drozofily „hobo“
Houbový transpozon (Ascobolus immersus) Ascot-1
Integrační faktory Escherichia coli
Hin invertasa salmonel
Genom člověka
V roce 1999 byl publikován seznam 19 lidských genů odvozených z transpozonů.
Podle údajů Mezinárodního konsorcia pro sekvencování lidského genomu (International
Human Genome Sequencing Consortium) z roku 2001 tvoří mobilní genetické elementy
téměř polovinu lidského genomu. V roce 2004 R. J. Britten z Kalifornského
technologického institutu uveřejnil, ţe mobilního původu můţe být aţ 89 % funkčních
lidských genů. Část z nich tvoří endogenní retroviry (ERV  z angl. Endogenous
RetroVirus) nebo jejich fragmenty. Pro srovnání, v myším genomu zabírají retrovirové
elementy 10 %, v genomech vyšších rostlin jsou zastoupeny ještě více (např. u kukuřice
z 50 % nebo u pšenice více jak z 90 %). Tato poměrně vysoká mnoţství retroelementů,
nacházejících se v dnešních eukaryotických genomech, jsou relikty dávných
retrovirových infekcí. Podle posledních a stále upřesňovaných údajů zaujímají 8,3 %
genomu člověka endogenní retroviry (HERV  angl. Human Endogenous RetroVirus),
retrovirové, tzv. dlouhé opakující se terminální struktury (LTR  angl. Long Terminal
Repeat structures) a mobilní elementy obdobné retrotranspozonům. O neobvyklém zájmu
o tuto problematiku svědčí rychlost, s jakou jsou objevovány nové a nové rodiny HERV.
V roce 2000 jich bylo známo 22, dnes uţ jich známe na 80 a předpokládá se, ţe jich bude
identifikováno více jak 100 (Tab. 7.4).
Tabulka 7.4. Zařazení lidských endogenních retrovirů (HERV) v rámci čeledi
retroviridae
Jednoduché retroviry
rod
Alpharetrovirus
Betaretrovirus
Gammaretrovirus
příklad
virus ptačí leukózy
virus nádoru mléčné ţlázy myší
opičí viry
virus leukémie myší
Komplexní retroviry
141
HERV
Třída II
Třída I
rod
Deltaretrovirus
Epsilonretrovirus
Lentivirus
Spumavirus
příklad
virus leukémie skotu
virus nádorů kůţe ryb
opičí viry
lidské a opičí viry (HIV, SIV)
lidské a opičí viry
HERV
Třída III
HERV se v našem genomu shromaţďovaly po 80 milionů let. Čas od času
propukaly mezi našimi předchůdci nemoci a epidemie vyvolané retroviry, podobně jako
dnes infikují exogenní retroviry SIV (z angl. Simian Immunodeficiency Virus) opice
anebo HIV-1 a HIV-2 (z angl. Human Immunodeficiency Virus), vyvolávající selhání
imunity u člověka (AIDS), které se od začátku 80. let minulého století stále šíří a uţ
nabylo charakteru pandemie. O retrovirech HIV se můţeme s vysokou pravděpodobností
domnívat, ţe mohou přinést evoluční inovace do genomu lidí. Je vysoce pravděpodobné,
ţe HERV urychlily evoluci určitých vývojových linií primátů směrem k člověku
(hominizaci). Nově integrované HERV přinášely nejen novou informaci, ale mohly
v genomu změnit pořadí exprese jiných, původních genů a poskytnout tak evoluční
výhody pro jejich nositele. Jak předpokládá R. Löwerová z Institutu Paula Ehrlicha
v Německu, takovou evoluční výhodou mohlo být přenesení rezistence proti řadě
původců jiných virových chorob. Exogenní retroviry totiţ po endogenizaci ztrácejí
virulenci, ale přitom zabraňují vstupu jiných exogenních virů. To mohlo napomoci přeţití
našich předků oproti jiným primátům, u nichţ k retrovirové endogenizaci nedošlo.
Existují také hypotézy, ţe HERV byly příčinou růstu lidského mozku a nebývalého
rozvoje neokortexu (šedé kůry velkého mozku, který je sídlem inteligence). Lidský
mozek je v průměru třikrát větší neţ mozek pravěkých i dnes ţijících opic. Fosilní nálezy
svědčí o tom, ţe k jeho zvětšování došlo u hominidů (v linii primátů vedoucí k člověku)
vícekrát. Začalo asi před dvěma miliony let a skončilo pravděpodobně před odštěpením
neandrtálců před 500 000 lety. A. Stengel z německého Národního centra pro ţivotní
prostředí a zdraví nedávno zjistil v lidském mozku expresi HERV, která nebyla prozatím
v opičím mozku zjištěna. Většina HERV uţ není schopna se dále v genomu rozmnoţovat
díky řadě mutací a jiných přeměn, přesto některé z nich kódují proteiny, které se dají
dobře detekovat. Přítomnost takových proteinů nebo jejich mRNA byla prokázána při
nádorových procesech, ale co je důleţité, také v řadě lidských tkání, kde se podílejí na
zabezpečení mnoha ţivotně důleţitých funkcí, např. při zrání spermií nebo embrya
v placentě (Tab. 7.5).
Tabulka 7.5. Příklady některých rodin herv a erv a exprese jejich mRNA
rodina
počet identifikovaných kopií mRNA
specifická exprese mRNA
HERV-E
30‒50
placenta, mozek, rakovina prsu
142
HERV-H
50‒1000
teratokarcinom
HERV-W
10‒100
placenta
HTDV/HERV-K
30‒50
spermie, placenta, nádory
HERV-K/T47D
30‒50
rakovina prsu, placenta
ERV-3
1
placenta, tkáně plodu, spermie
ERV-9
30‒50
teratokarcinom, placenta
O původu a evoluční historii jednotlivých rodin HERV je známo málo. Výjimku
tvoří rodiny označované jako HERV-H, HERV-K, HERV-L, HERV-W a MSRV (z angl.
Multiple Sclerosis RetroVirus). MSRV můţe být exogenní retrovirus, ale je pro svoji
podobnost řazen do podrodiny Herv-w. Byl izolován z buněčných kultur nemocných s
roztroušenou sklerózou. Později byl prokázán i u sklerotiků. HERV-W rodina patří dnes
k nejprozkoumanějším endogenním retrovirům. Zdá se, ţe HERV-W patří k
fylogeneticky nejmladším, vstoupily do genomu primátů ještě před rozštěpením opic
Starého a Nového Světa před 25 aţ 40 miliony let. Jeden z členů rodiny HERV-W si
zachoval kompletní provirovou genovou sekvenci exogenních retrovirů. Tento unikátní
gen env (z ang. ENVelope, obálka, virový obal) kóduje glykoproteiny, které dalšími
enzymatickými procesy dávají vznik syncytinu 1 a 2. Oba proteiny jsou více jak z 90 %
exprimovány v placentě a v pokusech in vitro se ukázalo, ţe způsobují splývání buněk
(buněčné fúze). Právě na nich závisí příprava děloţní sliznice (endometria) pro přijetí
oplozeného vajíčka a přeměna cytotrofoblastu na syncytiotrofoblast (nejen chránící
vyvíjející se plod, nesoucí cizorodé antigeny otce před imunitní reakcí matky, ale také
zajišťující transport ţivin, výměnu plynů a další metabolické a endokrinní funkce). Slabá
přítomnost syncytinu byla prokázána ještě ve varlatech, ale nikde jinde ze 23 typů
analyzovaných lidských tkání. Avšak na začátku tohoto století některé práce poukázaly
na fakt, ţe se při určitých zánětlivých onemocněních nervové soustavy zvyšuje mnoţství
některých proteinů ERV, zejména geny env, a to nejen u člověka a některých opic, ale
také u hlodavců a koček. U roztroušené sklerózy, která je provázena nahromaděním
zánětlivých buněk, demyelinizací a zánikem oligodendrocytů, je nacházeno zvýšené
mnoţství nám uţ známého syncytinu, který je kódován stejnými geny HERV-W. V roce
2004 byly publikovány výsledky úctyhodné spolupráce vědců z univerzit v Kanadě,
USA, Francii a Anglii, které prokázaly, ţe je to syncytin, který má na svědomí aktivaci
prozánětlivých molekul v nervové tkáni, je příčinou buněčné smrti nervových buněk, a co
je důleţité, ţe některé antioxidanty těmto jeho nebezpečným účinkům zabraňují.
Pangenom
Jestliţe si představíme celou biosféru jako sumu všech genů ze všech buněčných
organismů, virů a mobilních genetických elementů, dostaneme jediný gigantický soubor
genetické informace, z něhoţ čerpá biologická evoluce. V. V. Tetz ze Státní Pavlovovy
143
lékařské univerzity v Petrohradě nazývá tuto celoplanetární genetickou informaci
pangenom. Nejvýznamnější úlohu informačních zdrojů v něm přisuzuje prokaryotickým
mikroorganismům a virům. Jejich celková hmotnost se odhaduje na 7,5 miliard tun, coţ
převyšuje celkovou hmotnost rostlin (5,5krát) i ţivočichů (0,5krát).
V současné době známe sekvence genů v genomech 250 druhů prokaryot. To je
však jen zlomek z dosud popsaných 17 tisíc druhů bakterií, coţ je opět jen nepatrný díl
skutečného mnoţství bakteriálních druhů. V půdě přírodní louky se nalézá kolem milionu
odlišných mikrobiálních genomů a jen mikrobiota lidského střeva zahrnuje přes 300 000
genů, zatímco vlastní genom člověka má asi 25 000 genů.
Tato obrovská pestrost genomů se lidskými zásahy stále sniţuje. V zemědělsky
obhospodařované půdě se nachází uţ jen desetina genomů a v půdách znečištěných
průmyslovými spady klesne jejich počet na pouhou tisícinu. Na druhé straně, člověkem
řízený horizontální přenos genetické informace, neuváţené, masové zavádění GMO,
které některé geny upřednostňuje, můţe vést ke změnám v přirozeném koloběhu výměny
genetické informace a k rozkolísání ustavené rovnováhy planetárního ekosystému.
Závěry
Objev horizontálního přenosu genetické informace změnil náš pohled na ţivý
svět. J. Hoffmeyer z Institutu molekulární biologie kodaňské univerzity tvrdí, ţe příroda
podstupuje semiotizaci, tj. stále zvyšuje výměnu informace. Výměna informace je tudíţ
conditio sine qua non evoluce nových druhů. Horizontální přenos genetické informace
má v evoluci ţivých forem proto tak závaţnou úlohu, ţe je motorem hlavních evolučních
inovací, jako je např. výše zmíněný vznik adaptivní imunity čelistnatců.
V této souvislosti se přímo vnucují neodbytné otázky: Mohou se dnešní
nitrobuněční bakteriální parazité jako Salmonella, Shigella, Francisella, nebo dokonce
viry (viz podobnost RAG a HIV) stát přenašeči nové genetické informace, která
v konečném důsledku způsobí kvalitativní evoluční skok? Nebo to budou mobilní části
DNA jiných organismů, o jejichţ působení vůbec nic nevíme? Jak dlouho bude trvat, neţ
se evoluční inovace projeví? Bude to sto let, tisíciletí, nebo déle?
Uvaţujeme-li v tomto evolučním kontextu, je třeba si stále uvědomovat, ţe ţivé
formy se nikdy nevyvíjely v nějaké „splendid isolation”. Nebyla to evoluce, ale
koevoluce (jejíţ podstatou je horizontální přenos genetické informace), která vytvořila a
jistě dosud stále vytváří všechny druhy ţivých organismů na Zemi.
144
ŠKOLA MOLEKULÁRNÍCH BIOTECGHNOLGIÍ
PROFESSION
Vytiskl Tribun EU s. r. o., Gorkého 41, 602 00 Brno
www.knihovnicka.cz
Olomouc 2010