Buněčné kultury a produkce rekombinantních proteinů

Buněčné kultury
a produkce
rekombinantních proteinů
Ing. Mgr. Marta Greplová, Ph.D.
Buněčné kultury - definice
Procesy in vitro za účelem udržení životaschopnosti,
rozšíření a využití buněk živých organismů. Mohou to být
kultury prokaryotické (bakterie, mykoplasmy) a také
eukaryotické (kvasinky, prvoci, rostlinné a živočišné buňky).
Pojem buněčná kultura je v úzké souvislosti s výrazy tkáňová
kultura nebo orgánová kultura, za které bývá často zaměňován.
Přestože myšlenka kultivovat buňky in vitro pochází již z 19.
století, rutinně se kultivace používají od 50. let 20. století.
Alexis Carrel (1873-1944)
Dokázal, že orgány či tkáně
je možné dlouhodobě
udržet na živu i po vyjmutí
z organismu.
V roce 1912 vložil do živného roztoku
kus kuřecího srdce, jehož buňky
vydržely v kultivační nádobě 27 let.
Tento pokus způsobil průlom v rané
historii biologie a měl význam pro
rozvinutí metod genetických,
mikrobiologických a farmaceutických.
Od osmdesátých let se tak tkáňové kultury staly běžným nástrojem
nejen pro výzkum, ale začaly se používat i v průmyslu.
Buněčné kultury - význam
ve virologii - diagnostika virových onemocnění, kultivace a izolace
viru, výroba virových vektorů pro genovou terapii či výroba vakcín
proti virům (dětská obrna, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice)
výroba enzymů, hormonů, monoklonálních protilátek, interleukinů
a dalších proteinů pro léčebné, diagnostické či vědecké účely
využití sek. metabolitu jako příchutí, parfémů, insekticidů, sladidel …
testování látek, léčiv a jejich toxicity či teratogenity
výzkum rakoviny a vývoj protinádorových léčiv
studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk
klinická genetika - prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky
choriových klků), postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve),
chromozomové vyšetření nádorových buněk
tkáňové inženýrství
produkce transgenních plodin
Buněčné kultury - typy
1. Primární buněčné kultury - připravují se z různých orgánů
nebo jejich částí. Nejvhodnější jsou embrya nebo mladí jedinci.
Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky,
které jsou lépe přizpůsobeny daným podmínkám. Možnosti
dalšího pasážování v subkulturách jsou omezené - existují
zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se
rozmnožily, převést do nového média. Primární kultury mají
diploidní sadu chromozómů a zpravidla jde o směs různých typů
buněk původní tkáně (epiteloidní, fibroblasty).
Buněčné kultury - typy
2. Sekundární (diploidní) kultury – vycházejí z
primárních kultur a vznikají z buněk, které se v podmínkách
in vitro začaly rozmnožovat. Mají rovněž diploidní
chromozomovou výbavu, ale oproti primárním kulturám
obsahují pouze jeden vyselektovaný typ buněk. Biologické
vlastnosti těchto buněk jsou podobné jako v podmínkách in
vivo, mohou se pasážovat až 50 x zhruba po dobu 1 roku
(zkracování telomer).
Buněčné kultury - typy
3. Buňečné linie (heteroploidní) - získávají se cílenou selekcí
z primárních kultur pomocí fyzikálních či chemických mutagenů
nebo přímo z nádorových buněk (HeLa). Jsou plně adaptovány
na podmínky in vitro a mohou být pasážovány neomezeně
dlouhou dobu. Jejich charakter se však mění během pasážování
a buňky v kultuře se často liší velmi výrazně od buněk tkání, ze
kterých byly získány. Jejich charakteristickým znakem je
heteroploidní počet chromozómů.
Základní principy buněčných kultur
Izolace buněk
Buněčná kultura se zakládá izolací určitého typu buněk ze zvířete,
člověka či rostliny.
K izolaci se používají nejrůznější techniky založené na mechanické
disociaci tkáně a trávení pomocí proteolytických enzymů (trypsin,
kolagenáza) v přítomnosti EDTA (váže Ca2+).
Separace buněk ze suspenze probíhá na základě rozdílných fyzických
vlastnosti (různé velikosti a hustota  centrifugace) nebo tendenci
určitých typů buněk silně se lepit na sklo či plast (oddělení od buněk,
které se lepí méně).
Buněčný separátor
aktivovaný fluorescencí
Technika využívá protilátku spojenou s
fluorescenčním barvivém pro označení
určitých buněk.
Buňky jsou pomocí mírného proudu vpraveny
do kapiláry, kde se mohou pohybovat pouze
jedna za druhou a pomocí laseru je
fluorescenční značka aktivována a měřena
fluorescence každé jednotlivé buňky.
Na výstupní trysce se pomocí vibrací
vytvářejí miniaturní kapky, každá obsahující
většinou jen jednu buňku. Kapky se
automaticky nabijí buď pozitivně nebo
negativně. V silném elektrostatickém poli
jsou potom kapky odchýleny podle svého
náboje a tím nasměrovány do patřičného
sběrného kontejneru.
Fluorescence activated cell sorter
Přístroj je schopen přesně vybrat 1
fluorescenční buňku z 1000 neoznačených a
vytřídit několik tisíc buněk každou vteřinu.
Základní principy buněčných kultur
Podmínky kultivace
Práce s buněčnými kulturami vyžaduje vhodně vybavenou
laboratoř, vyškolené pracovníky a zvláštní spotřební materiál.
Jedním z hlavních požadavků je
udržení sterility a zabránění
kontaminacím. Je vhodné pracovat
ve vyhrazené čisté laboratoři
podléhající speciálnímu režimu.
Mezi základní pomůcky patří
laminární box, inkubátor s řízenou
atmosférou a inverzní mikroskop
vybavený fázovým kontrastem.
Používá se sterilní jednorázový plast,
kultivační nádoby s upraveným
povrchem a chemikálie určené pro
práci s buněčnými kulturami.
Většina buněk může žít, množit se a exprimovat diferenciační
charakteristiky in vitro v kultivačních nádobách.
Pro růst buněk je důležitá optimální teplota (37°C), přístup kyslíku
(filtry) a CO2 (udržení pH medií; zvýšený parciální tlak, 5-7.5%), a
také vysoká relativní vlhkost.
Buňky mohou být kontinuálně pozorovány pod mikroskopem anebo
biochemický analyzovány. Tak je možné studovat vliv buď přidání nebo
odebrání specifické molekuly (hormony, růstové faktory) a také
interakce mezi různými buněčnými typy.
Většina buněk získaných z tkání vyžaduje pro svůj růst pevný povrch
na který se uchytí. Dno plastové misky modifikované chemicky nebo
gama zářením takový povrch poskytuje. Často musí být miska pokrytá
nějakou z komponent extracelulární matrix (kolagen, laminin,
fibronektin) aby buňky přežívaly a dělily se.
Některé buňky jsou schopné proliferovat v suspenzi bez nutnosti adheze.
Kultivační media
hlavní anorganické ionty (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-)
stopové prvky
zdroj energie (glukóza)
aminokyseliny
pufrující složku (CO32-/HCO3-, HPO42-/H2PO4-)
vitamíny a jiné složky různých enzymů
mastné kyseliny a lipidy
specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové
faktory)
antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)
acidobazický indikátor (fenolová červeň)
sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)
Růstová křivka buněčné kultury
vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase
růst buněčné kultury prochází několika fázemi:
 Lag-fáze – počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a
pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí
a připravují se k buněčnému dělení.
 Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – počet buněk
exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze,
což lze využít pro chromozomové vyšetření.
 Stacionární fáze (plató)– rychlost růstu populace postupně klesá,
projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce
růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média.
 Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk
způsobenému nedostatkem živin, snížením pH (následkem zvýšení
koncentrace CO2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a
hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.
Růstová křivka buněčné kultury
Log10
(h)
Různé buněčné linie se při nízkých hustotách chovají různě. Stejně
tak se různé linie liší i svým chováním před dosažením plató. Většina
buněčných kultur časem dosáhne konfluence – na kultivačním
povrchu se vytvoří hustá, prakticky souvislá vrstva buněk, které se
vzájemně dotýkají. Konfluentní kultura je přitom uspořádána do
jediné vrstvy (monolayer), pak se další množení buněk zastaví.
Některé buněčné linie ovšem konfluence nikdy nedosáhnou (např.
endotelie), dělení buněk se zastaví dříve – například jakmile se
jednotlivé buňky začnou dotýkat třeba jen svými výběžky. Naproti
tomu například některé nádorové buňky kontaktní inhibici postrádají,
takže rostou i po vytvoření jednoduché konfluentní vrstvy.
Pasážování buněk
Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne
na neúnosnou míru.
Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto
suspenzi přenést do další kultivační nádobky.
Dlouhodobé kultivace buněk lze dosáhnout
pasážováním, kdy se buňky přesadí do nové
kultivační nádobky, jakmile pokryjí její dno ze 70%.
Subkultura
Rostlinné buněčné kultury
Tabák BY-2
Produkce rekombinantních proteinů
1982 – produkce lidského insulinu v E. coli
1986 – uvedení na trh prvního proteinu vyprodukovaného v savčích buňkách
V první řadě je nutné zvážit, jaký expresní systém bude vhodný pro
produkci rekombinantního proteinu a tomu přizpůsobit následující
klonovací postup:
izolace cDNA kódující daný protein
navrhnout, sestavit, izolovat a namnožit expresní plasmid
vnesení plasmidu do vhodného hostitele
Volba expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinantního
proteinu, potřebou zachovat nezbytné posttranslační modifikace,
rozpustnosti proteinu a jeho požadovaným množství.
Co zaručuje funkčnost proteinu?
1. správná konformace (folding)
2. asociace všech podjednotek (kvartérní struktura)
3. správná lokalizace v buňce (sorting)
4. posttranslační modifikace (irreverzibilní)
5. vazba kofaktorů (koenzymy)
6. regulace aktivity (reverzibilní modifikace)
Posttranslační modifikace
1) Proteolytický sestřih (štěpení)
2) Tvorba disulfidických (cysteinových) můstků
•
vazba S-S cysteinů na různých místech řetězce
•
bakterie - periplazmatický prostor, DsbA a DsbB
•
eukaryota - pouze v ER (vhodné redoxní prostředí),
PDI
•
(protein disulfid izomeráza)
- tvorba a korekce S-S můstků
redukční prostředí - rozpad S-S
Proinzulin
Posttranslační modifikace
3) Chemické modifikace (připojování skupin)
• Glykosylace (N-glykosylace na Asn, O-glykosylace na Thr, Ser)
•
Acetylace (N konec)
•
Metylace (Arg, Lys)
•
Fosforylace (Tyr, Ser, Thr, His, Asp)
•
Karboxylace (Glu, Asp)
•
Hydroxylace (Pro, Lys)
•
Alkylace
4) Membránové kotvy
• GPI kotva (C konec) – glykofosfatidylinositol kovalentně spojuje
protein s fosfolipidem na buněční membráně
• farnesylace
• myristylace
• palmitylace
Fúzní proteiny
usnadnění izolace rekombinantního proteinu, detekce
translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a:
a) krátký peptid [ (His)n, (Asp)n, (Arg)n ...]
 chelatační afinitní chromatografie (IMAC)
b) přirozený oligopeptid [MBP, CBD, GST, Trx, SUMO, intein ...]
 pozitivní změny kvality a kvantity exprese
(často zvýšení solubility rekombinantního proteinu,
ochrana před proteolýzou, stabilizace proteinů)
 uniformita purifikace
fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit (faktor Xa,
thrombin, enterokinasa, SUMO proteáza, DTT)
Expresní systémy
Živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro
produkci bioorganických látek, především proteinů.
Bakteriální systémy – Escherichia coli, Bacillus subtilis
Kvasinkové systémy – Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
Hmyzí systémy – bakulovirus v buňkách Spodoptera frugiperda
(vojnice)
Savčí buňky – CHO
nebo Trichoplusia ni
(Chinesse hamster ovary),
kidney),
HeLa, 3T3
(Kovolesklec cizokrajný)
HEK (293T)
(human embryonic
(Swiss mouse embryonic fibroblast cells)
Expresní systém vs. velikost proteinu
Kvasinky
Savčí
buňky
Hmyzí
buňky
+++
+++
+++
+++
++
+++
+++
++
E.coli
<8kDa
+++
Fúzní proteiny
>8kDa
Intracelulární
proteiny
8-50kDa
Sekretované
proteiny
>50kDa
Sekretované a
povrchové proteiny
+++
Výtěžky expresních systémů
v průmyslové praxi
Protein
[g/l biomasy]
E. coli
Kvasinky
P.pastoris
S.cerevisiae
Sekretovaný
<0,5
0,2÷4
≤0,25
Intracelulární
rozpustný
0,5÷5
0,2÷12
1÷4
Intracelulární
inkluze
0,5÷5
1÷4
Savčí
buňky
Hmyzí
buňky
0,001÷0,1 0,001÷0,5
0,001
Charakteristika
E.coli
Kvasinky
Savčí
buňky
Hmyzí
buňky
Buněčný růst
rapidní (30min)
rapidní (90min)
pomalý (24h)
pomalý (18-24h)
Požadavky na růstové
medium
minimální
minimální
komplexní
medium
komplexní
medium
Cena růstového media
nízká
nízká
vysoká
vysoká
Množství proteinu
velké
malé až velké
malé nebo
střední
malé až velké
Extracelulární exprese
sekrece do
inkluzních tělisek
sekrece do
media
sekrece do
media
sekrece do
media
Extracelulární exprese
Skládání proteinů
obvykle nutné
dodatečné
složení
v některých
případech nutné
dodatečné
složení
řádně složené
proteiny
řádně složené
proteiny
N-glykosylace
-
vysoký obsah
manosy
komplexní
jednoduchá, bez
sialové kyseliny
O-glykosylace
-
+
+
+
Fosforylace
-
+
+
+
Acetylace
-
+
+
+
Acylace
-
+
+
+
γ-karboxylace
-
-
+
-
Transformace bakterii a kvasinek
buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá kompetentní
přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus influenze, Streptococcus pneumoniae…
všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního
stavu dvěma způsoby:
Chemická transformace
Buňky se ošetří roztokem
CaCl2/RbCl na ledě, který způsobí
větší permeabilitu membrány.
DNA se smísí s těmito buňkami a
po krátké inkubací (adheze DNA
na povrch buněk) se provede tzv.
„heat shock“ (30-60s 42°C).
Elektroporace
Vystavení buněk elektrickému
šoku (10-20 kV/cm), což vede
ke krátkodobé depolarizaci
buněčné membrány a to umožní
vniknutí cizorodé DNA do buněk.
Bakteriální expresní systémy
Escherichia coli
Výhody:
- organizmus s dobře charakterizovaným genomem a proteomem
- design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů
- rychlý růst a nadprodukce rekombinantních proteinů
- levné a jednoduché na manipulaci
- vhodné linie E.coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy i obří
bacmidy (>100kb)
Nevýhody:
- absence eukaryotních posttranslačních systémů
- tvorba inkluzních tělísek (0,2÷0,6mm)
- preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota
- kontaminace proteinů lipopolysacharidem (endotoxin)
Bakteriální plasmidové vektory
plasmidy, kosmidy a bakteriofágy
extrachromosomální elementy s autonomní replikací
malá velikost – vysoká účinnost transformace, klonování
velkých DNA fragmentů
Klonovací vektory – umožňují snadné vložení libovolné
sekvence DNA; musí obsahovat počátek replikace, selekční
marker a klonovací místo (polylinker/MCS)
Expresní – obsahují silné promotory a umožňují efektivní
přepis vložené sekvence DNA do mRNA a následnou produkci
proteinů v hostitelské buňce
Shuttle (podvojné, kyvadlové, binární, pendlující) – mohou se
množit ve více organismech; musí obsahovat dva počátky replikace
Vektory pro klonování DNA
E. coli TOP10F`- indukce IPTG pro blu/white screening
Buňky transformované prazdným vektorem budou exprimovat LacZ a-peptid
modré kolonie na X-gal/IPTG agaru.
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-[beta]-D-galactopyranoside)
IPTG (isopropyl-[beta]-D-thiogalactopyranoside)
Vektory pro expresi genů
Klonovací místo (MCS)
Selekční gen pro
rezistenci k antibiotiku
Operátor
vazebné místo pro represor
promotor
Enhancer translace
Ribozom - vazebné místo
Fúzní značka (His tag)
Regulace exprese pod T7 promotorem
exprese naklonovaného genu je
kontrolována velice silným promotorem z
bakteriofága T7, který původně řídí expresi
genu 10 pro obalový protein.
před indukci IPTG probíhá bazální exprese
T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný
produkt toxický pro bakterii, nedojde k
selekci, selektují se pouze mutované klony,
které neprodukují rekombinantní protein.
T7 RNA polymerasa
Regulace exprese pod T7 promotorem
pro expresi je nutno dodat do
hostitelským buněk T7 RNA polymerasu
a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její
indukovanou expresi.
kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen
pod lacZ promotorem. Tento konstrukt je vložen do genu pro
integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice
v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen
je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez
přítomnosti induktoru (IPTG).
někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a
pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt
pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě
plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym
(produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou
expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol.
T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat
bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7
RNA polymerasa se dostane z této inhibice.
T7 lysozym je bifunkční enzym,
který má navíc vlastní lytickou
funkci, naštěpuje bakteriální
peptidoglykanovou stěnu a
usnadňuje tak následnou
izolaci exprimovaného
proteinu.
BL21(DE3)LysS
Ideální situace pro expresi v E. coli
Protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem
Velikost proteinu je < 50kDa
Není nutná glykosylace (prokaryotycké geny buď eukaryotní geny
jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím; většiná
cytosolarních proteinů)
Geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA
(podobný genetický kód, evoluční příbuznost)
Protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci
Protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností
refoldingu
Všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě
Lokalizace rekombinantních proteinů
Lokalizace rekombinantních proteinů
Ovlivnění rozpustnosti proteinů
snížení teploty kultivace (18-25°C)
použití slabšího promotoru
fúzní značka
snížení koncentrace induktoru exprese (IPTG)
periplasmatická exprese (disulfid-isomerasy a foldasy)
Rovnice Wilkinsona- Harrisona pro určování rozpustnosti proteinů
R  K   D  E   0,03
 N G PS 
CV  1 


 2
n
n


Rozpustnost proteinu zaleží
na parametru CV-CV´.
CV-CV´<0 rozpustný protein
CV-CV´>0 nerozpustný protein
n = počet aminokyselin
N,G,P,S = počet Asn, Gly, Pro a Ser
R,K,D,E = počet Arg, Lys, Asp a Glu
λ1, λ2 = koeficienty (15,43 a -29,56)
CV´= 1,71
Postup při izolaci proteinů z inkluzních tělísek
Biomasa
Dezintegrace buněk
(French press, soninikace, lysozym)
Buněčný
extrakt
Centrifugace
30min, 10000xg
Sediment
Inkluzní
tělíska
6-8M Gu-HCl + DTT
8M urea + DTT
Denaturační činidla
Membránová frakce
Celé buňky
Inkluzní tělíska
Refoldovaný
protein
Denaturované
proteiny
Monomerní a
redukované
proteiny
Denaturované
proteiny
Purifikované
proteiny
Přístupy pro refolding proteinů
Kontrolovaná renaturace s minimálním vznikem agregátů
Dialýza
Ředění
Chromatografie (LC, GPC), zeolit
Fosfolipidy
Detergenty a povrchově aktivní látky (Tween, TritonX-100, PEG, SDS)
Alkohole s krátkými řetězci (n-pentanol, n-hexanol, cykloheksanol)
Sacharidy (glycerol, sacharosa, glukosa, N-acetyl glukosamin)
In vivo folding – enzymy (disulfid isomerasa, chaperony)
Monitorování % refoldingu



Enzymatická či biologická aktivita
Protilátky proti nativní konformaci proteinu
Spektroskopické metody – fluorescence, CD spektra
Chaperony
Napomáhají při stabilizaci nesbalených nebo částečně sbalených
proteinů pomocí tvorby nekovalentních interakcí, a proto usnadňují
jejich sbalování do správné konformace.
Skupina I
• v bakteriích a také v chloroplastech a mitochondriích
• ATP-ázy
• nejsou specifické ke svým ligandům
• dříve označovaný jako heat shock proteins (Hsp)
• nejlepé charakterizovaný je komplex GroEL/GroES v E.coli (Hsp60)
Skupina II
• Archaea a v cytosolu eukaryot
• CCT chaperony
(chaperonin containing TCP-1 Ring Complex)
• nepoužívají kofaktor
GroEL – double-ring 14mer
GroEL/GroES
GroES – single-ring heptamer
Aktivní komplex obsahuje 14 kopií GroEL a 7 kopií GroES
Tvorba komplexu GroEL/GroES
vyžaduje velikou konformační
změnu cis GroEL prstenu, která
mění vnitřek komplexu z
hydrofobního na hydrofilní a ruší
symetrií obou prstenů GroEL.
Energie pro konformační změnu
komplexu je získána diky navázání
ATP a jeho odbourání do ADP+P.
U prokaryot je sbalování
individuálních domén proteinů
přesunuto až do úplného
polypeptidového řetězce, který
je skládán pomocí riobosomu.
Naopak domény proteinů eukaryot jsou sbalovaný postupně a na
sobě nezávislé.
Při heterologní expresi velkých multidoméních proteinů v E.coli
může proto dojit k agregaci a také tvorbě inkluzívních tělisek. Bylo
prokázáno, že jejich tvorba může být potlačena diky společné
expresi proteinů s chaperoniny GroEL/GroES.
Bakterialní expresní systémy
Bacillus subtilis
Výhody:
- není lidský patogen (má status GRAS – „generally regarded as safe“)
- neprodukuje žádné endotoxiny
- má vyvinutý výkonný sekreční systém (jednodušší zpracování proteinů)
- nemá podstatné odchylky v genetickém kódu (codon usage bias)
- rychlý růst v levných mediích do vysokých koncentrací kultury
- jednoduchá transformace díky přirozené kompetenci
- standardizované kultivační techniky (fermentace)
- vysoká kvalita proteinů (buněčný systém kontroly kvality)
Nevýhody:
- malá stabilita plasmidů
- malé výtěžky rekombinantních proteinů (omezené využití)
- extracelularní proteasy degradující heterologní proteiny
Laboratorní a průmyslově využívané kmeny
Bacillus subtilis mají tyto mutace:
◊ delece genu produkujícího tenzidy (surfactin - srfC)
◊ delece genu produkujícího červený pigment (cypX nebo yvmC)
◊ delece genu pro extracelularní proteasy
(neutral proteases, subtilisin, metalloprotease,
bacillopeptidase F, wall-bound protease)
◊ delece genu pro intracelularní proteasu
WB800 (nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsr Δvpr wprA::hyg cm::neo)
kmen Bacillus subtillis deficientní na osm proteas, využívaný na produkci
heterologních proteinu, které jsou vylučovaný do média
Využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a
amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější
zdroj kyseliny hyaluronové (farmakologie)
B. subtilis expresní vektory
ITPG-inducible
(MoBiTech)
xylose-inducible
cold-inducible
Kvasinkové expresní systémy
eukaryontní systémy, které obecně mnohem vhodněji posttranslačně
modifikují rekombinantní proteiny eukaryontního původu
sekrece proteinů je dobře realizovatelná připojením sekrečních
signálů
jednoduchá genetická manipulace
příprava expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je
nezbytné selektovat a charakterizovat několik expresních klonů, neboť
obvykle se intenzita tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon
od klonu (multicopy insertions)
růst v levných mediích do vysokých koncentrací buněčné suspenze
dosažitelná sekrece rekombinantního proteinu a podíl sekretovaného
proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou je
1% pro S. cerevisiae a 10% pro P.pastoris
Kvasinkové expresní systémy
Sacharomyces cerevisiae
Promotory:
Silné: alcohol dehydrogenase (ADH1),
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAP),
phosphoglycerate kinase (PGK)
Přesněji regulované: galactose (GAL1),
copper-binding metallothionein (CUP1),
acid phosphatase (PHO5)
Selekční markéry:
Komplementace auxotrofních mutaci
(Leu, Ura, Trp)
Resistence vůči antibiotikům
(Geneticin, Blasticidin)
S. cerevisiae strain phenotype: His-, Leu-, Trp-, Ura-
Zpracování sekretovaných proteinů
a-MF prepro peptide (a-factor)
1. Protein je exprimován v jádře
spolu se signálním peptidem.
2. a-MF vede protein do ER, kde
signalní peptid je částečně
odstraněn signální peptidasou.
3. Dále protein pokračuje do Golgi
a Kex proteáza odstraňuje a-MF.
4. Protein je sekretovaný do media.
Kvasinkové expresní systémy
Pichia pastoris
Promotory:
alcohol oxidase (AOX1),
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP)
formaldehyde dehydrogenase (FLD1)
Selekční markéry:
Biosyntetické markéry (geny P. pastoris:
ADE1 (PR-amidoimidazolesuccinocarboxamide
synthase), HIS4 (histidinoldehydrogenase),
ARG4 (arginosuccinate lyase), URA3 (orotidine5´-phosphate decarboxylase), URA5 (orotatephosphoribosyltransferase))
Resistence vůči antibiotikům (Zeocin,
Geneticin, Blasticidin)
Resistence na formaldehyd (FLD1)
Kvasinkové expresní systémy
Pichia pastoris
Exprese rekombinantních proteinů v Pichii
Klonováni genu do vektoru pGAPZα/pPIC
Linearizace konstruktu
Transformace kompetentních buněk Pichia pastoris
Homologní rekombinace
Selekce transformantů
Exprese rekombinantního proteinu
Exprese proteinů ve velkém měřítku
Typy fermentačních procesu
Vsádkový (batch) - všechny živiny jsou vloženy do procesu již na
počátku, metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ
procesu
Přítokovaný (fed-batch) – k základnímu objemu v bioreaktoru
přitéká další médium s novými živinami, metabolity se opět
hromadí
Kontinuální – existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou
zadržováni, nebo odtékají
Fermentor
přesné dávkování
regulovaná teplota (30°C)
pH (KOH)
obsah kyslíku (případně jiných plynů)
míchaní
antifoam
dokrmování (50% glukóza)/indukce (MeOH)
25
Harvest
Fed-batch start
120
100
80
15
60
10
40
5
20
0
0
0
10
20
30
40
50
Cultivation time [h]
60
70
80
90
OD600
Dissolved oxygen [%]
20
Odlišnost glykosylace
proteinů v Pichii
vysoký obsah manosy je
immunogenní pro
člověka
produkce terapeutických
proteinů v P. pastoris je
možná díky zavedení
lidského systému
glykosylace (GlycoFi)
dodatečné enzymy:
manosidasa I a II,
transferázy galaktozy,
N-acetylglucosaminy a
kyseliny sialové
Kvasinkové expresní systémy
Kluyveromyces lactis
intra- a extracelularní exprese
silný LAC4 promotor
selekce bez antibiotiků, acetamidáza
(amdS) umožňuje využití acetamidu
jako jediného zdroje dusíku v mediu
mnohočetné integrace expresního
plasmidu  vyšší výtěžek proteinů
průmyslova produkce chymosinu
(výroba sýrů)
Savčí expresní systémy
Výhody:
- produkují proteiny správně posttranslačně modifikované i správně
sbalené
- možnost kultivaci ve fermentoru
- rekombinantní proteiny produkované v savčích buňkách se
používají ve farmacii a pro další preklinické studie
Nevýhody:
- rostou pomalu a výtěžek je relativně nízký
- jejich kultivace je finančně náročná
- různé klony CHO buněk mají odlišné vyživovací požadavky –
náročná optimalizace media
Savčí expresní systémy
Nejvyšší výtěžnost dosahují linie lidských embryonálních
ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka
čínského (CHO).
Pro dosažení vysokého výtěžku je nutné připravit stabilně
transfekovanou linii buněk, což znamená, že vnesený gen kódující
příslušný rekombinantní protein se musí integrovat do genomu
buněk a potom se množí společně s množícími se buňkami.
Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí
recesivní nebo dominantní selekce.
Savčí expresní systémy - selekce
Dominantní selekce znamená použití chemikálie normálně toxické pro
buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenž se produkuje z
genu lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein.
Selekce stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyžaduje
průběžné monitorování míry exprese proteinu, neboť se může stát, že
jinak dojde k selektování klonu rezistentního na selekční markér, ale
neprodukujícího dostatečné množství rekombinantního proteinu.
Selekční markery
Dominantní selekce
 může být použita pro každý typ buněk
 rezistence vůči určitým antibiotikům:
•
G418 – neomycin fosfotransferáza
•
hygromycin – hygromycin B fosfotransferáza
•
puromycin – puromycin acetyltransferáza
 biosyntetické markery – transfekce dává buňce schopnost prototrofie
•
tryptofan syntetáza
•
histidinol dehydrogenáza
Selekční markery
Recesivní selekce
 hostitelská buňka musí být deficientní v selekční vlastnosti
 enzymy purinové a pyrimidinové biosyntetické dráhy
 když je de novo syntéza purinů a pyrimidinů inhibována buňky
využívají alternativní dráhy ke přeměně nukleotidových prekurzorů
•
thymidin kináza
•
hypoxantin-guanin fosforibosyltransferáza
•
adenine fosforibosyltransferáza
buňky deficientní v enzym alternativní dráhy hynou;
selekce – chybějící enzym je dodán společně s transgenem
 využitelné pro amplifikaci DNA transgenu
 dihydrofolát reduktáza + metotrexát (selekce po několik měsiců)
 ornitin dekarboxyláza + a-difluoromethylornitine
Savčí expresní systémy
Linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO)
Poprvé představeny v 60. létech 20. století, dnes nejčastěji používané
savčí buňky pro produkci rekombinantních proteinů v průmyslovém
měřítku.
CHO buňky se často používají v cytogenetice, kvůli malému počtu
chromosomů (2n=22).
Poskytují modelový systémem ve výzkumu genetických změn v
kulturách savčích buněk.
Savčí expresní systémy
Linie lidských embryonálních ledvinných buněk
HEK (293T)
Tyto buňky byly poprvé připraveny roku 1970 v laboratoři Alexe Van der
Eba v Leidenu v Holandsku. Byly získány ze zdravého potraceného
lidského plodu, poprvé kultivovány jako primární HEK (human embryonic
kidney) buňky. Později byly upraveny transformací pomocí pěti
adenovirových genů (Graham a kol., 1977).
Buňky HEK 293 se používají pro produkci rekombinantních proteinů,
relativně jednoduše se kultivují i transfekují. Protože se jedná o lidské
buněčné linie, zajišťují tyto buňky naprosto všechny posttranslační
modifikace, které jsou pro daný rekombinantní protein potřeba, používají
se tedy pro produkci lidských terapeutik a pro klinický výzkum. Lze je
také poměrně snadno převést do většího produkčního objemu, takže jsou
zajímavé i pro průmyslovou produkci rekombinantních proteinů.
Přenos DNA do buněk
1. Virové vektory (SV40, retroviry, alfaviry, vakcinie, ss a ds adenoviry)
2. Fyzikální metody:
a) elektroporace
b) mikroinjekce (původní jádro buňky se odsaje a nahradí se
jádrem s rekombinantně upraveným genomem)
3. Chemické metody:
a) CaPi precipitace (založeno na koprecipitaci DNA s fosforečnanem
vápenatým, vytvořený komplex pak adheruje na povrchu buněk,
5 % CaPi/DNA precipitátu se dostává do buněk fagocytózou)
b) lipofekce (pozitivně nabité lipidy tvoří elektrostatické interakce s
negativní páteří DNA, vznikají kondenzované agregáty, kde
kladný náboj a lipofilie pozitivně nabitých lipidů umožňuje
interakci se zápornou a hydrofobní buněčnou membránou a
následný vstup do cílové buňky)
c) syntetické komplexy DNA-ligand (kondenzace DNA s
polykationtem (PEI;DEAE-dextran), vhodná metoda pro
transientní transfekce díky jednoduchosti a relativně nízké ceně)
Hmyzí expresní systémy
Bakulovirus expression vector systém (BEVS)
Bakuloviry - obalené viry z čeledi Baculoviridae, s genetickou
informací v dvouvláknité, kruhové DNA (134 kbp)
bakuloviry jsou druhově specifické, infikují jen bezobratlý
mezi nejčastější hostitele patří nedospělé larvální formy hmyzu,
zejména řády Lepidoptera, Hymenoptera a Diptera a řád korýšů
(Decapoda)
k nejvíce prostudovaným a využivaným bakulovirům patří virus
AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)
virus AcMNPV byl původně izolován z hmyzích buněk housenek druhu
Spodoptera frugiperda (vojnice)
gen pro tvorbu proteinu je do produkčních buněk přechodně vnášen
formou infekce bakulovirem a nedochází ke stabilní transfekci
Životní cyklus bakulovirů v infikovaných hmyzích buňkách.
V hostitelské buňce jsou tvořeny dvě formy virových částic: viriony
shromažděné do okluzí (ODV) v jádře a pučící viriony (BV) dozrávající při
průchodu plazmatickou membránou. V přírodě mají okluze funkci
ochrannou před působením vnějšího prostředí. Spolu s potravou se
dostávají do těla larev hmyzu, kde jsou rozpuštěny ve střevě v alkalickém
prostředí a dostávají se fúzí do epitelových buněk střeva. Cílem
nukleokapsidu je jádro, kde probíhá replikace a transkripce nukleové
kyseliny. Pučící virus podporuje sekundární infekci okolních buněk.
Hmyzí expresní systémy
Bakulovirový expresní systém využívá přítomnosti rekombinantího
bakuloviru se začleněným heterologním genem, který je pod kontrolou
silného polyhedrinového promotoru pPolh, a buněčných linií hmyzích
buněk Sf-9/Sf-21, odvozených od ovárií druhu Spodoptera frugiperda
TM
nebo HighFive - Trichoplusia ni kultivovaných in vitro.
Hmyzí expresní systémy
polyhedrinový promotor umožňuje expresi polyhedrinu nebo
rekombinantního proteinu - až 50% celkového proteinu na konci
cyklu bakuloviru
rekombinantní gen je vnášen do oblastí virového genomu, které
nejsou nutné pro replikaci viru
začlenění genu se děje homologickou rekombinací s využitím
sekvencí vektoru - rekombinantní bakulovirus ztrácí jeden z
postradatelných genů, který je nahrazen genem rekombinantním
heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní
infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více
expresními kazetami
bacmid - binární vektor, který se může replikovat v E.coli a
hmyzích buňkách, nese rezistenci na kanamycin a gen lacZ
Příprava bakuloviru
Hmyzí expresní systémy
Plaque assay – stanovení titrů virů, nutný pro úspěšnou infekci
Plaque-forming unit
Hmyzí expresní systémy
Výhody:
- bakuloviry nejsou lidské/rostlinné patogeny, neprodukují endotoxiny
- možnost produkci proteinů ve fermentoru (buněčné linie Sf-9 jsou
vhodné pro kultivací v suspenzi)
- vysoká exprese rekombinantních genů, většina proteinů je rozpustná a
jednoduše se získává z infekovaných buněk
- posttranslační modifikace proteinů
Nevýhody:
- dlouhá, několikafázová příprava rekombinantního bakuloviru
- nutnost titrovat rekombinantní bakulovirus – plaque assay
- náročné udržování a kontrola suspenze rekombinantních virů
- kultivace hmyzích buněk vyžaduje pravidelnou péči
- zavedení systému je pro experimentální laboratoř finančně náročné
Využití rekombinantních proteinů
Základní výzkum:
struktury
modifikace
funkce
metabolických drah
imunitních odpovědí
Aplikovaný výzkum/ biotechnologický průmysl
cytokiny (IL-2)
hormony (inzulín, lidský růstový hormon, thyrogen)
výroba terapeutických protilátek
vakcíny (Hepatitis B)
diagnostické a terapeutické soupravy
potravinářství, textilní průmysl, papírnictví, čistící prostředky
2002 – 250 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy
Lidský inzulín
inzulín – hormon (51 aa) produkovány
β buňkami Langerhansových ostrůvků
slinivky břišní
inzulín pro léčbu diabetiků byl
extrahován z slinivky prasat a krav
někteří diabetici však produkovali
protilátky proti živočišnému insulinu
lidský inzulín se začal syntetizovat
uměle (drahé)
1982 poprvé připraven pomocí rDNA
technologie
od devadesátých let se produkuje ve
velkém a levně lidský insulin pomocí
transgenních E.coli nebo kvasinek
(např. Humulin®)
HB vakcína
hepatitis B je jednou s nejčastějších infekčních nemoci
podle odhadu WHO 285 mln lidi je nositeli viru
tradiční vakcína využívá buď atenuované nebo mrtvé viry, které díky
antigenní podobnosti jsou schopny navodit protektivní imunitu
v červnu 1986
Recombivax HB byl
schválený jako preventivní
vakcína proti hepatitis B
rekombinantní vakcína
využívá povrchní antigen
viru, který stimuluje
produkcí protilátek
Lidský růstový hormon (HGH)
produkovaný hypofýzou je důležitý regulátor vývoje člověka
nedostatkem růstového hormonu (GHD) trpí jen v USA 15 000 děti
pravidelné injekce hormonu mohou obnovit normální růst
HGH se izoloval s hypofýz lidských a jehněčích mrtvol (velice drahé a
velká spotřeba mrtvol)
v 1985 Protropin® byl
schválený v 67 státech
pro lečbu GHD u děti
litr bakteriální kultury
vyprodukuje 5mg
hormonu za 15 hodin
(dříve půl milionu
jehněčích mozků)
Využití rekombinantních bakterií
v potravinářství